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1、1第六章 污染环境的生物修复第一节 生物修复概论第二节 土壤的生物修复第三节 污染水体的生物修复第一节 生物修复概论一、生物修复的基本概念二、生物修复的研究内容三、生物修复的技术方法四、生物修复的设计程序生物修复也称生物恢复 （ biorestoration） 、生物清除（ bioelimination） 、生物再生 （ bioreclamation） 或生物净化（ biopurificaton） ，是利用生物特别是 微生物 （包括土著和外来的）的代谢活动、或其代谢产物 降解 或 富集 有毒、有害污染物，从而恢复被污染环境的一个受控或自发进行的生物学过程生物修复分类原位生物修复（ in sit
2、u）异位生物修复 (ex situ)生物修复的地点就是污染现场运用 生物 采用 工程技术 方法处理污染的技术。是采取就地解决问题的技术方案 无需将污染物转移需通过某种途径将被污染物从污染现场运到一指定地点进行 集中处理一、生物修复的基本概念大家可试着查阅生物修复的文献,以下是我查的结果,70篇文献中: 目标污染物： PAH和OC有34篇，石油10篇，金属14篇，其它7篇 目标环境： 土壤46篇，水11篇，水与地13篇 研究内容： 生物物种选择与改造14篇，反应技术17篇，管理4篇，机理17篇，生态学9篇首次：1989年 3月 24日， Exxon石油公司 Valdez号油轮在 Alaska的
3、Prince William海湾触礁，发生溢油事故，泄漏到海湾的原油达 4200万升，污染的海岸线长达 500600km生物修复的发展2首次： 美国xxon公司和美国环保局联合实施的 “阿拉斯加研究计划 ”。采用原位生物修复技术，通过向污染海域投加 N、 P营养物（ 亲油性肥料：氮源是含尿素的油酸,磷源是三磷酸酯），促进自然存在的降解菌的生长，从而强化石油污染的生物降解处理结果表明，同未施加营养物的水域相比，喷施营养物的区域，石油污染程度明显减轻，并且未向周围水域扩散生物修复的发展工人正在向被 石油污染 的海滩喷洒营养液，促 使吃石油的 细菌 长起来。优点：破坏了污染物，且污染物不会迁移它处工
4、人暴露危险减少便宜、安全、快捷，但过程复杂，评估技术重要生物修复的优点生物体对污染的不可利用性污染物对生物的毒性多种污染物与有机化合物共存时，细菌会选择天然有机化合物污染物的不完全降解现场的不可预测性生物修复影响因素二、生物修复的研究内容 物种： 微生物、植物 反应技术条件： 反应条件的控制 机理： 可脱离现场 生态学： 安全性评价 管理： 现场实验、现场评估（前后均需要） 物化： 地下水流动时、空情况；基本营养物质生物修复选用的物种 微生物： 直接将外源降解性微生物接入土壤或水体，依靠其特有的代谢活动，清除污染物 植物： 种植相应的能够富集、积累或降解污染物的植物3二、生物修复的研究内容反应
5、技术条件：9 营养物质9 电子受体9 表面活性剂三、生物修复的技术方法1、物种的选择2、原位生物修复技术3、异位生物修复技术4、原位 -异位联合修复技术微生物1、物种的选择植物土著微生物外来微生物基因工程菌不吸收或少吸收重金属将吸收的重金属钝化在植物地下部分，使其不向地上部分转移大量吸收重金属元素，植物仍能正常生长1、物种的选择1) 降解菌的筛选2) 构建工程菌3) 植物土壤修复中的作用1）降解菌的筛选Continous decrease in concentration of additional C-sourceSamples from contaminated habitats (soi
6、l, sediments,waters, sewage etc. or screening of present strains)Pre-enrichment with degradable analogues of XPre enrichment with complex media (e.g., nutrient broth)+XContinuous substitution of degradable substrate by xeno-biotic analogueDirect enrichment using X as sole source of carbon and energy
7、Direct enrichment using X as sole N-, P-, or S- source in the presence of additional C-sourcesTotal degradation of XCo-culture with bacteria degrading modified compoundModification of the chemical structure of X;cooxidation从污染点（土壤、底泥、水、 污水）取样，或筛选现有菌株用外源性化合物的类似物预富集培养用加了该化合物的复合营养基富集培养用该化合物可降解的类似物连续替代直
8、接用该化合物作为唯一碳源、能源富集培养用该化合物作为唯一 N、 P、或 S源，另加 C源，直接富集培养连续减少补加的碳源化合物降解菌与修饰的化合物降解菌共培养改变化合物结构或共代谢作用诱变技术原生质体融合基因工程育种工程菌2）构建工程菌4第一例基因工程实验克隆：无性繁殖过程。 有分子克隆、基因克隆、单克隆目的基因分离目的基因与载体DNA的连接重组DNA转化原核细胞外源基因在细胞中的表达分子克隆分子克隆分子克隆1）目的基因分离酚抽提变性法煮沸法甘油提取DNA后，先组建它的几种限制性酶的 物理图谱 ，并进行基因的定位，随之从该DNA限制性消化片段的电泳凝胶上回收目的基因，供基因重组使用提取质粒酚抽
9、提法 适用于大规模地制备质粒 DNA 步骤：接种含质粒菌体、收获细胞，游离原生质（用溶菌酶破碎菌体细胞壁，释放 DNA），去除蛋白质和 Ch-DNA（用 1MNaCl沉淀染色体 DNA和SDS-蛋白质的复合物），抽提质粒，质粒分离干燥，溶于缓冲液中备用变性法 适用于小规模提取重组质粒 DNA 在溶菌酶和 SDS破壁释放质粒 DNA后，在强碱条件下， DNA变性成为单链。以醋酸中和，使质粒 DNA复性为双链，而其他仍为沉淀，质粒可直接用乙醇沉淀上清液，分离质粒 DNA煮沸法 适用于小规模地检验和大规模地制备质粒 DNA 在溶菌酶和 Triton破壁释放 DNA后，迅速煮沸，使Ch-DNA和蛋白质
10、沉淀，质粒 DNA留在溶液中5物理图谱：有限制性内切酶的位点、片段数、方向性2）目的基因与载体DNA的连接主要载体：质粒： 与细菌细胞共生的能独立复制的染色体外遗传单位，其基因组由环状双链共价闭合DNA组成。如：万能质粒PBR322。思考做载体的质粒需要具备的条件？病毒： 转入动物噬菌体： T4、M13、分子克隆单一限制酶位点筛选标记：便于筛选阳性重组子2）目的基因与载体DNA的连接 载体与目的基因是用相同的限制性内切酶消化，使两者具有相同的粘性末端。将目的基因与载体消化物混合，二者的粘性末端通过碱基间氢键配对互补插入式：取代式分子克隆同一种限制性酶消化外源 DNA和载体 DNA，将外源DNA
11、插到载体 DNA缺口中连接而重组 DNA两种限制性酶同时消化载体，除去载体的一个小段DNA，再用同样的两种酶消化外源 DNA，将消化后的外援 DNA与载体片段连接代替去掉的那个小片段DNA，重组 DNA3）.DNA体外扩增1. 加热变性： 95，1-2分钟，DNA由双链单链2. 复性： 55 ，1-2分钟，让引物与模板配对3. 延伸： 72 ，在Taq DNA 多聚酶作用下，适当条件下，四中单核苷酸有序逐一地连接到引物上，并沿着模板方向合成新的DNA，最后一次5分钟4. 分离： 电泳分离以上三过程反复循环20-30甚至50次分子克隆4）重组 DNA转化受体细胞 制备感受态细胞： 经 CaCl2
12、处理之后的敏感细胞具有较高的转化率 将感受态细胞与重组 DNA混合，通过转化程序导入： 转化或转染 阳性重组子的筛选：1. 平板筛选：表型，为初步过程2. 电泳法筛选：分子探针3. 同源重组法：只适合筛选以噬菌体作为载体组建的重组体 （在一个有琥珀校正基因的质粒 VX中，克隆进去一段外源真核目的基因片段）分子克隆检测（1）蓝白斑实验（2）分子杂交法： 分子探针 是指利用放射性同位素或荧光物质等标记的特 异性核苷酸DNA或RNA分子(单链)。 通过碱基互补的关系，分子探针的单链分子与被考察DNA的单链分子形成共价结合。其产物中的同位素通过放射性自显影测定，反映出杂交产物的存在及其数量，或是通过测
13、定荧光物质，达到同样的目的。6（1）蓝白斑实验lacI PO lacZ lacY lacAmRNA阻遏蛋白+IPTG(异丙基-D-硫代半乳糖苷）结构基因产生半乳糖苷酶+X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷）释放吲哚产生蓝色（2）分子杂交法分类： 用 DNA或 RNA作为分子探针鉴别 DNA的分子杂交称为Southern blot 用 DNA或 RNA作为分子探针鉴别 RNA的分子杂交称为Northern blot 用标记的蛋白质或 DNA作为分子探针鉴别蛋白质分子称为Western blot三类分子杂交操作均可将被鉴定的大分子转移到硝酸纤维薄膜(ND)或尼龙膜上，在薄膜上分子探针与被
14、签定的核酸、蛋白质分子发生反应。（2）分子杂交法步骤： 用琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA变性待测DNA（碱液）待测变性DNA转移至硝酸纤维素薄膜上鲑鱼精子DNA预杂交目的基因正式杂交放射显影鸟枪法基本过程：某个限制性酶消化DNA，得到许多DNA片段将消化所得的DNA消化物与同一酶消化的载体DNA的产物用连接酶连接，获得多种类型的重组DNA分子转化受体细胞后，再从中筛选出含目的基因DNA片段的重组体细胞从中筛选出符合要求的工程菌构建过程相同内切酶消化 电泳片段挖下基因片段克隆筛选目标基因片段测DNA序列发现成功注册7基因工程菌的安全性 存活情况 基因的稳定性 在其他非目标环境中的规律 对生态系统的
15、副作用3）植物在生物修复中的作用即使在污染物浓度较低时也有较高的积累速率能在体内积累高浓度的污染物能同时积累几种金属生长快，生物量大具有抗虫抗病能力思考？超积累植物是指对重金属元素的吸收量超过一般植物 100倍以上的植物。目前已发现 400多种超积累植物3）植物在生物修复中的作用对重金属污染的修复对有机污染物的修复植物固定： 使环境中的金属流动性降低、生物可利用性下降、降低金属对生物的毒性植物挥发： 植物将污染物吸收到体内后又将其转化为气态物质释放到大气中植物吸收： 利用 植物 吸收环境中的金属离子，将它们输送并贮存在植物体的地上部分直接吸收 有机污染物释放分泌物和酶 ，刺激根区微生物的话性和
16、生物转化作用增强根区的矿化作用， 菌根对放射性核素的修复植物可以从污染的土壤中吸收并积累大量的放射性核素土壤水质净化利用大型水生植物进行富营养化水体的净化已经成为国内外治理湖泊水体富营养化的一项重要措施三、生物修复的技术方法1、物种的选择2、原位生物修复技术3、异位生物修复技术4、原位 -异位联合修复技术2、原位生物修复技术引入生物改变生物生活环境投加活菌法 （ Bioangmentation）植物修复 （ Phytoremedying）培养法 （ Culture）生物通气法 （ Bioventing）翻耕法（ Landfarming）投加活菌法通过发酵工程获得 大量活性 微生物并直接将之撒布到遭受污染的土壤和水体中辅加该微生物良好生长所必需的营养物质8种植植物拥有庞
