《项目四-pcr扩增目的基因---大肠杆菌丝氨酸羟甲基转移酶基因(glya)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《项目四-pcr扩增目的基因---大肠杆菌丝氨酸羟甲基转移酶基因(glya)（76页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、基因操作技术,第三章 PCR技术,聚合酶链式反应(po;ymerase chain reaction ,PCR),提 纲,一、PCR技术简史 二、PCR的基本原理 三、PCR的反应条件 四、PCR的类型和应用 五. PCR引物设计及相关软件使用,一、PCR技术简史,DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明,引物酶,引物酶,DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明,一、PCR技术简史,DNA 聚合酶,DNA 聚合酶,DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明,一、PCR技术简史,DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明,一、PCR技术简史,生物样品,
2、DNA片段,基因诊断,基因治疗,基因工程产品,法医学检测,人类学研究,基因组DNA,获取特定DNA片段,扩增特定DNA片段,DNA聚合酶,引物,引物,引物,引物,Mullis的构思,DNA聚合酶,DNA聚合酶,94变性,50-65退火,XX延伸,94,55,37,Taq DNA聚合酶,酶活性(%),温度(),40 50 60 70 80 90 100,100 80 60 40 20,Taq DNA聚合酶,Taq聚合酶是一种耐热的DNA聚合酶，由于发现于水生栖热菌（Thermus aquaticus）内，故命名为Taq聚合酶（Taq polymerase），也称为TaqDNA聚合酶，简称Taq酶
3、或Taq。Taq聚合酶常见于PCR技术，用于大量扩增DNA片段。,命名,Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1株分离提取的.yT是 一种嗜热真菌,能在7075生长.该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离的.,Taq DNA聚合酶,水生栖热菌是一种生长在温泉、蒸汽管道等处的细菌，它体内的Taq聚合酶可以耐受90以上的高温而不失活。 一般适用于DNA片段的PCR扩增、DNA标记、引物延伸、序列测定、平末端加A等，产物可直接用于T-A载体克隆。,应用,Taq DNA聚合酶,Taq聚合酶的最适温度为75-80C，72C时能在10秒内复制一段100
4、0bp的DNA片段。这种较高的酶活性有明显的温度依赖性。低温下，TaqDNA聚合酶表现活性明显降低，90C以上时合成DNA的能力有限。,热稳定性及最适延伸温度,Taq DNA聚合酶,Taq聚合酶的缺点之一为催化DNA合成时的相对低保真性。它缺乏35核酸外切酶的即时校正机制，出错率为1/9000。,低保真性,72,94,55,PCR循环,PCR过程 PCR的特点,重复13步 2530轮,目的DNA片段 扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链 与引物复性,DNA变性 形成2条单链,子链延伸 DNA加倍,二、PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,模板DNA,二、PCR的基
5、本原理,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,二、PCR的基本原理,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,二、PCR的基本原理,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,二、PCR的基本原理,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,二、PCR的基本原理,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第2轮结束,二、PCR的基本原理,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,模
6、板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,PCR过程 PCR的特点,二、PCR的基本原理,三、PCR的反应体系,PCR反应体系 PCR影响因素,三、PCR的反应体系,PCR反应体系 PCR影响因素,三、PCR的反应体系,PCR反应体系 PCR影响因素,三、PCR的反应体系,PCR反应体系 PCR影响因素,三、PCR的反应体系,PCR反应体系 PCR影响因素,三、PCR的反应体系,PCR反应体系 PCR影响因素,如何设计PCR反应体系？,PCR产物的保存,未纯化的PCR产物-20放上一周没有什么问题。 纯化后若以干粉状态可在-20保存好几个月，若溶于Tris可保存一两
7、个月。注意不要用纯水溶解。,四.PCR引物设计及相关软件使用,（一）. 引物设计的基本原则,引物长度（primer length） 引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin） 引物C+G含量与退火温度 (melting temperature) 引物5端设计,1. 引物的长度,一般为15-30bp，常用的是18-27bp.,2. 引物二聚体及发夹结构,产生引物二聚体带会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行,引物的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。 退火温度55左右 退火温度+510 =Tm值 Tm值(解链温度)=4(G+C)2(
8、A+T),3.引物的GC含量和复性温度,4.引物5端设计,对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。,（二）. Premier 5.0 引物设计软件简介,Primer Premier 5.0 的使用技巧简介,主要功能: 1、即引物设计 2、限制性内切酶位点分析 3、DNA 基元(motif)查找 4、同源性分析,Primer Premier 5.0使用介绍(1),Preimer Premier 启动界面,Load sequence,基本信息,Sequence name,Original sequence,Use these two but
9、ton to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好,Choose a function,引物设计界面,First you can design the primer manually,Sense strand or anti-sense strand,Useful information of the primer,引物搜索选项设定,引物类型,搜索模式,5引物位置范围,3引物位置范围,产物大小范围,引物长度,搜索结果,28对引物,引物分值 100分为满分,每对引物的信息,双击选中
10、一对引物,引物信息,回到主窗口,引物及产物信息,是否出现hairpin,dimer,false priming and cross dimer,一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有 But ,引物编辑,引物编辑,Edit primer here,Analysis the edit result,Accept the edit result Return to the main window,PCR仪,(一) PCR基因扩增仪的类型,PCR仪，也称DNA热循环仪、基因扩增仪 PCR基因扩增仪的设计均按照DNA变性、复性和延伸三个环节以及温度均恒、传导快和升
11、降温迅速等原则，结合传感技术、微电子技术和电子计算机等技术发展而成的自动化和智能化的仪器设备,1. 水浴式PCR基因扩增仪,水浴式PCR基因扩增仪一般由三个不同温度的水浴槽和机械臂组成，样品管分别浸于三个水浴槽中，完成变性、复性和延伸三个过程，反应管在每个槽中停留的时间和槽间移动通过微电脑及其控制的机械臂完成。 国内生产厂家有： 华美生物工程公司(ZW1型) 北京新技术研究所（1109型） 天津第二医学院(TE1型) 中科院遗传研究所（PCR90A型） 上海复旦生物技术所（FR800型）等。,PCR仪器的变迁,2. 气流式PCR基因扩增仪,气流式PCR仪主要由对流恒温箱（机壳）、热气源、冷气源
12、、控制器等组成，将样品管置于对流恒温箱中，由控制器控制热空气枪、热辐射源和大功力风扇，以提供冷热空气，变换反应管的温度。,3. 金属模块式PCR基因扩增仪,上面分布数量不等的样品管孔，采用电阻加热、压缩机制冷、半导体调制温度或电子调制温度。 该机体积小，升降温速度快，样品基座温度准确、均一度高，自动化程度高，扩增程序容量较大，检测样品数目多，可用于普通0.5ml管，检测结果稳定可靠性高，是目前国内外生产和使用较为普遍的PCR基因扩增仪。 国内外生产厂家主要有： 美国PE公司（PT系列） MJ公司（PCT系列） Ericomp公司（TCX系列）等等， 珠海黑马医学仪器公司（Hema 480型）
13、西安康怡公司CY系列，南京桑利司（SL1型） 军事医学科学院（JK236B型） 中科院遗传研究所（PCR90B型）等。,维护注意事项,(1) 注意本机的使用环境条件和电源； (2) 机盖开关要轻，以防损坏盖锁； (3) 严禁工作时打开机盖； (4) 定期用中性肥皂水清洗样品槽，严禁使用强碱、有机溶液和高浓度酒精擦洗； (5) 有故障时请有专业知识的维修人员或厂家技术人员维修。,PCR反应条件的选择？,PCR反应条件为温度、时间和循环次数 一般分为8步： 1、预变性：可用9495，210min,一般用5min。 2、变性：一般用94，30s2min,一般45s1min。 3、退火：温度自定，30
14、s2min。 4、延伸：7075，一般72，对于2kb,2kb,每增加1kb加1min。 5、循环数：一般2535个循环。 6、最终延伸：72，515min。 7、保存：10，时间设为0。 8、END。,PCR仪操作指南,步骤： 1、开机：打开开关，视窗上显示“SELF TEST”,显示10秒中后，显示RUN-ENTER菜单： 准备执行程序。 2、放入样本管，关紧盖子。 3、如果要运行已经编好的程序，则直接按Proceed（继续），用箭头键选择已储存的程序，按Proceed，则屏幕显示： 按Proceed选择ENABLE（enable启动），则开始执行程序。 4、如果要输入新的程序，则在RUN
15、-ENTER菜单上用箭头键选择ENTER PROGRAM,按Proceed，屏幕显示,按Proceed， 1）选择NEW,命名新的程序，最多8个字母，输入后按Proceed确认(如何输入字母、数字)。 2）输入程序步骤：名字输入后，显示 。 按Proceed则可以输入温度（0100）， 按Proceed确认后，则可以输入孵育时间（用秒计算），用Select键移动光标，输入数字，完成后按Proceed确认，跳到下一步，输入方式同上。 3）选择GOTO，输入循环步骤时链接到第几步（循环数最多可达9999次）(为实际循环数1)。 4）选择End,输入结束步骤。 5、输入完成的程序后，到RUN-ENTER菜单，选择新程序，开始运行。,6、其它：用pause可以暂停一个运行的程序，再按一次继续程序。 用stop或Cancel可停止运行的程序。 编辑程序： 1、可以用Cancel键删除输错的值，输入新的值后按Proceed确认。 2、对于未输完的程序，要先输入END，按Proceed将程序储存后才能删除。 3、删除已经储存的程序：从RUN-ENTER菜单中选择RUNPROGRAM，按Proceed，显示主菜单，选择DELET,用Select选择删除。 4、查看程
