发干线粒体dna提取改良法的建立、缺失类型的筛选及其缺失量与年龄的关系

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1、中山大学 硕士学位论文 发干线粒体DNA提取改良法的建立、缺失类型的筛选及其缺失量 与年龄的关系 姓名：郑一诫 申请学位级别：硕士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：周俊宜 20090608 中山大学硕士学位论文发干线粒体D N A 提取改良法的建立、缺失类型的筛选及其缺失量与年龄的关系 发干线粒体D 从提取改良法的建立、 缺失类型的筛选及其缺失量与年龄的关系 研究生：郑一诫 导师：周俊宜副教授 中文摘要 毛发是犯罪现场上最常见的物证检材之一。发干的传统方法检验主要集中在 形态学的对比上。随着毒化技术和分子生物学技术的发展和运用，发干分析检验 内容已经成功地扩展到毒化分析和个人识别领域。但

2、目前，对于发干的年龄推断 仍然没有可靠有效的方法。不带毛囊的发干的主要成分是角质蛋白和微量的线粒 体D N A 。线粒体D N A 缺失在衰老过程中扮演着重要的角色，并且其缺失量有随 着年龄增加而增加的趋势，因而，线粒体D N A 缺失或许可以成为发干年龄推断 研究的切入口。 前期的研究已经证实，m t D N A 的多种大片段缺失与年龄存在密切的关系， 例如：1 3 1 6 2 b p 、7 6 6 3 b p 、7 6 3 4 b p 、1 0 4 2 2 b p 、4 9 8 9 b p 和4 9 7 7 b p 缺失等。但这些 缺失类型是否存在于发干当中、其缺失量与发干的年龄关系如何仍

3、然未见系统的 研究报道。 此外，从发干中提取线粒体D N A 仍然是一个难点，虽然国内外文献均有相 关方法的研究报道，但在实际运用中均存在缺点。分析发干提取中的影响因素及 建立适合本实验的方法是研究毛发m t D N A 缺失情况的前提条件之一。 研究目的 本研究主要探讨发干中提取m t D N A 的方法、发干中m t D N A 缺失类型及其 缺失量与年龄的关系： ( 1 ) 对比多种从发干中提取m t D N A 的技术，并建立经济、高效和适合本 实验的方法。 一I 一 中山大学硕士学位论文发干线粒体D N A 提取改良法的建立、缺失类型的筛选及其缺失量与年龄的关系 ( 2 ) 明确发干

4、中是否存在线粒体D N A1 3 1 6 2 b p 、7 6 6 3 b p 、7 6 3 4 b p 、1 0 4 2 2 b p 、 4 9 8 9 b p 和4 9 7 7 b p 缺失，以探讨缺失类型及其缺失发生率与年龄的关系。 ( 3 ) 分析不同年龄发干线粒体D N A 缺失的量，明确缺失量与年龄的关系， 探讨m t D N A 缺失实时定量技术在发干年龄推断中的运用价值，尝试建立毛发年 龄推断的新指标。 主要研究的内容及结果 第一部分多种发干m t D N A 提取方法的对比及改良方法的建立 1 1 利用c h e l e x 1 0 0 法对2 0 份无染色发干m t D N

5、 A 进行提取和P C R 扩增，其扩增 成功率为7 5 。 1 2 利用N a O H 法对2 0 份无染色发干m t D N A 进行提取和P C R 扩增，其扩增成 功率为7 0 。 1 3 利用压发机对发干进行碾压破坏其外层蛋白结构后，采用自配消化液 ( 1 0 0 m m o l l1 1 i s H C l ，1 m m o 】1E D T A ，l T r i t o l l X 1 0 0 ，l m m l 蛋白酶K ， 8 0 r n I n o l lD T T ) 进行发干消化，建立改良法。对2 0 份无染色发干m t D N A 进行 提取和P C R 扩增，其扩增成功

6、率为9 0 。 1 4 利用N a O H 法对1 0 份染色发干m t D N A 进行提取和P C R 扩增，其扩增成功 率为5 0 。 1 5 利用c h e l e X - 1 0 0 法结合M i c r o c o n l0 0 纯化柱对1 0 份染色发干m t D N A 进行提 取和P C R 扩增，其扩增成功率为8 0 。 1 6 单纯利用改良法对l O 份染色发干m t D N A 进行提取和P C R 扩增，其扩增成 功率为2 0 。结合D N A 吸附纯化柱纯化后，其扩增成功率为8 0 。 第二部分发干m t D N A 缺失类型的筛选 2 1 针对4 9 7 7 b

7、p 缺失类型，在缺失位点两侧设计特异性引物对9 0 份不同年龄的 发干进行P C R 筛选，并对阳性模板进行测序认证。有8 9 份样品检测到4 9 7 7 b p 缺失，其缺失发生率为9 8 9 ，测序结果显示其缺失片段大小为4 9 7 7 b p ，与理 论值一致。 中山大学硕士学位论文发干线粒体D N A 提取改良法的建立、缺失类型的筛选及其缺失量与年龄的关系 2 2 针对1 3 1 6 2 b p 、7 6 6 3 b p 、7 4 6 3 b p 、1 0 4 2 2 b p 和4 9 8 9 b p 等缺失类型，在缺失位 点两侧设计特异性引物对9 0 份不同年龄的发干进行P C R

8、筛选，均未发现其P C R 扩增产物。 2 3 对阴性模板的扩增条件进行优化，在采取更换P r 硫e S T A RH SD N A P o l y m e r a S e 、提高M 孑+ 浓度、采用二次扩增的方法等提高扩增体系灵敏度等措施 后，仍未检见1 3 1 6 2 b p 、7 6 6 3 b p 、7 4 6 3 b p 、1 0 4 2 2 b p 和4 9 8 9 b p 缺失的目的片段。 第三部分m t D N A 4 9 7 7 b p 缺失实时定量P c R 探针法的建立与不同年龄发干缺失 量的分析 3 1 分别扩增m t D N A 4 9 7 7 b p 缺失和M T

9、N D l 基因，并连接到P M D 1 9T 载体上， 经过蓝白斑筛选、P C R 扩增筛选和测序认证，成功构建m t D N A 4 9 7 7 b p 缺失重组 质粒和M T N D l 重组质粒。 3 2 分别以M T N D l 和m t D N A 4 9 7 7 b p 缺失标准品进行1 0 的倍数稀释后，取六 个浓度进行扩增( 从1 1 0 5p g 至1p g ) ，M T N D l 标准品的C T 值与起始模板量 的关系公式为y = 1 3 4 衄X ) + 1 7 5 4 ，R 2 = O 9 9 7 7 ，R 2 O 9 9 ，两者之间具有良好 的依存关系；m t D

10、 N A4 9 7 7 b p 缺失标准品的C T 值与起始模板量的关系公式为y = 1 3 7 l n ( x ) + 1 8 1 l ，R 2 = O 9 9 8 4 ，R 2 O 9 9 ，两者之间具有良好的依存关系； 3 3 对9 0 份从5 天至9 1 岁的不同年龄发干样品进行m t D N A 4 9 7 7 b p 缺失定量， 共有8 9 份样品检测到m t D N A 4 9 7 7 b p 缺失，阳性率为9 8 9 ，缺失量为O 至 1 4 3 6 士O 2 0 8 6 之间， 3 4 统计学分析显示m t D N A 4 9 7 7 b p 缺失与年龄之间存在一定的相关性(

11、 r = 0 6 3 9 ， P 09 9 ，两者之删具有良好的依存关系；从上述结果可看出，本 实验建立的实时定量P c R 探针法的c T 值能很好的反应其起始m c D N A 量，具有 较高的可靠性。 j 纾矿 憨f 删 ( A ) 广雳季雾 秣譬 f B l 。引弋：5 引、 ( D 1 1 5 m 大学硕十学位沦文发l 域牲体删A 提取拽自法的建n 、缺失类型的拚选其缺失讨5 年龄的盖系 图3 5m I D N A4 9 7 7 b 口缺失与M T N D l 标准曲线及c T 与起始量的关系曲线图。 ( A ) M T N D l 标准品以十倍浓度稀释的扩增圈( 从lx10 5p

12、g 至1p g ) 。( B ) 1 I I 【D N A 4 9 7 7 b p 缺失标准品以1 倍浓度稀释的扩增圈( 从lx 1 0 4p g 至lp g ) 。 ( c ) M T N D l 标准品c T 与起始量的关系曲线图。( D ) 咖D N A4 9 7 7 b p 缺失标 准品c T 与起始量的关系曲线罔。 F 培3 - 5m t D N Aa m p I m c m 帕“p I o t sa n ds t a I l d 盯dc u r v 髂( A ) A m p l i n c m 幻“p b to f 1 0 _ f 0 Hs 盯l a ld i l u t I o

13、n s ( 劬mlx1 0 P gt o1p 曲o ft h ca m p l l c o ns I a n d a r df o r M 丌D N l ( B ) A m p l i 6 c a “0 “p 】o t o f 】0 墒Hs e n a ld l l u t l o I l s ( 疳o m lx 1 旷p g f 0 1p g ) o f t h ea r n p l i c o ns l a n d a r d 南r t h e4 9 7 7 b pd e l d 帕n ( C ) 乳皿d a r dc u r v e so fd l s p l a y l “g a v

14、e r a g ec Tv a l u e s 曲mt h ee x p e r l m e l l tf o rM T N D I _ ( D ) S t a n d a r dc L l r v e so f d “p l a y m ga v e r a g ec T v a l u e S 曲mt h eo x p e n “ n tf o rt h e4 9 7 7 b pd e l e t 坶“ 23 实时定量P c R 探针法的特异性评价 23 1 核基因组( 不舍m t D N A ) 的实时定量P c R 扩增结果 本实验以核基因组( 不含m t D N A ) 为模板，以检

15、测1 I l t D N A 4 9 7 7 b p 缺失和 M T N D l 的引物和探针进行实时定量扩增，如图3 6 所示，两者的扩增图谱均星 直线状，未见起峰信号，说明奉实验所采用的定量方法在核基冈组中不会产生假 阳性检测信弓。 ( A )( B ) 图3 6 以核基因组( 小含m I D N A ) 为模板进行m c D N A 4 9 7 7 b 口缺失和M T N D 的实时定量P c R 扩增的矧谱一( A ) l T l t D N A 4 9 7 7 b 口缺失的扩增图谱。( B ) M T N D 一4 6 ，I - I 大学顿十学位皓文 发f 世粒体D N A 提取文自

16、法的建口、缺失凳型的筛选艟其缺失量与年船舶盖系 的扩增图谱。 飚3 - 6A m P l i f j 咖1 0 n 山t so f 曲g n u c l e a r D N Aa s t e m p l m e 血d d e c t 吨m f 】) N A 4 9 7 7 b pa J l dM T N 肌( A ) A m p l i n c m l o op l o to fm t D N A4 9 7 7 b p ( B ) A m p l 讯c a t i o n p l o to f M T N D l 232 不舍M T N D l 的m t D N A 实时定量P c R 扩增结果 本实验在M T N D l 基凼两侧反向设计引物扩增不含M T N D l 的I I I 【D N A ，并以 此为模板，进行检测M T N D l 的实时定耸扩增，如幽3 7 所示，扩增图谱未见起 峰信号说明本史验所采用的定量方法在m l D N A 的M