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1、山东大学 硕士学位论文 及早补充益生菌对NICU早产儿消化道及免疫功能的影响 姓名：张凤娟 申请学位级别：硕士 专业：儿科学 指导教师：孙正芸 20080516 山东入学硕j ：学位论文 符号说明 英文缩写英文全称 N I C UN e o n a t a li n t e n s i v ec R r eu n i t C 3 b R RC 3 b r e c e p t o rr o s e t t e I C RI m m u n ec o m p l e xr o s e t t e R F E RR B C C 3 bi m m u n ea d h e r e n c ee n h
2、 a n c e f a c t o rr o s e t t e E R I FR B C C 3 bi m m u n ea d h e r e n c ei n h i b i t o r f a c t o rr o s e t t e C R C o m p l e m e n tr e c e p t o r I F N 呵I n t e r f e r o n g a m m a I LI n t e r l u k i n e E L I S A E n z y m e - l i n k e dI m m u n o s o r b e n tA s s a y C DC l
3、 u s t e rO fD i f f e r e n t i a t i o n C F U C o l o n yf o r m i n gu n i t P E C Y 5 P h y c o e r y t h r i nc y a n i n5 F l T CF l u o r e s c e i ni s o l h i o e y a n a t e P E P h y e o e r y t h r i n P B M C P e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a rc e l l G A lTG u ta s s o c
4、 i a t e dl y m p h a t i ct i s s u e P P P e y e r 7 Sp a t c h L PL a m i n ap r o p r i a M B C M a j o rh i s t o e o m p a t i b i l i t yc o m p l e x A P C A n t i g e np r e s e n tc e l l D C D e n d r i t i cc e l l C T L C y t o t o x i cTl y m p h o c y t e H L AH u m a nl e u c o c y t
5、 e a n t i g e n 珊T u m o rn e c r o s i sf a c t o r T G F T r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r 中文全称 新生儿重症监护室 C 3 b 受体花环率 免疫复合物花环率 红细胞受体花环促进率 红细胞受体花环抑制率 补体受体 干扰素吖 自细胞介素 酶联免疫吸附试验 分化群 菌落形成单位 藻红蛋白花青营5 导硫氰酸荧光素 藻红蛋白 外周血单个核细胞 肠相关淋巴组织 派尔集合氏淋巴结 固有层 主要组织相容性复合体 抗原递呈细胞 树突状细胞 细胞毒性T 细胞 人白细胞抗原 肿瘤坏死函予 转化
6、生长因子 l O 山东人学硕士学位论文 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本 文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标 明。本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名： 盎凰西 E l期：堕：篁：! 垒 ， 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电 子舨，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据
7、库进行检索，可以采用 影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：堂咀导师签名：嵫 尽 期：兰L 旦 2 山东大学硕上学位论文 及早补充益生菌对NIC U 早产儿消化道及免疫功能的影响 研究生：张凤娟 导师：孙正芸 专业：儿科学( 新生儿) 中文摘要 背景及目的肠道微生态系统对机体健康的建立和维持发挥重要作用，肠 道益生菌更是引起临床和科研工作者的重视。 益生菌可以改善或纠正紊乱的消化道菌群，治疗便秘和腹泻，但对早产几 的临床应用并不多。益生菌的免疫调节作用目前受到广泛重视，其活菌、灭活 菌、菌体裂解物及基因组D N A 等均具有免疫调
8、节功能，但目前的研究主要集中 在离体细胞实验或动物实验，早产几临床研究鲜觅。 早产儿的免疫学状态与婴幼儿及成人不同。目前认为，早产儿出生时免疫 器官和免疫细胞已发育成熟，其免疫防御能力低下是因为以往未接触抗原刺 激，未能建立免疫记忆反应。 新生儿重症监护室( N I C U ) 的早产儿处于相对限菌环境，抗生索应用，无 法进行母乳喂养，需要接受多种医学操作，以上因素均可导致早产夕L 消化道难 常菌群建立的延迟和肠道益生菌数量的减少甚至缺乏。 培菲康是国内主要益生菌制剂之一，为粪肠球菌、嗜酸乳杆菌、长型双歧 杆藏三联活菌胶囊，含菌量分别不低于1 0 C F U ，经盈给药后霹以分别定植在肠 道的
9、上、中、下部位，并分别于1 2 h 、2 4 h 及4 8 h 内进入生长稳定期，从而组 成了一个在不同条件下都能生长，作用快而持久的联合菌群，在整个肠道粘膜 表露形成一道生物羼障。 本临床研究对N I C U 住院早产几补充益生菌制剂培菲康，观察临床消化道 症状，检测外周血相关免疫学指标，探讨及早补充益生菌对N I C U 早产儿消化 道和免疫功能的影响，为早产J 乙临床应用益生菌及对于益生菌对早产凡免疫状 态影响的进一步研究提供一定的理论基础。 4 山东大学硕t 学位论文 方法根据研究目的和临床可操作性设定出研究对象纳入标准，依据该标 准从山东省立医院N I C U 中的住院早产儿纳入研究
10、对象5 0 例，随机分为对照组 和益生菌组，各2 5 例，益生蓠组于开奶后即给予口服益生菌帝荆t 4 d 。观察 住院期间临床消化道表现，包括温盐水灌肠次数和腹泻发生率；采集生后1 4 - - - 1 6 d 股静脉血，采用郭峰花环率法检测红细胞C 3 b 受体花环率( R B C - C 3 b R R ) 、 红缁胞免疫复合物花环率( R 既一I C R ) 、红细胞C 3 b 受体花环促进率( R F E R ) 及 红细胞C 3 b 受体花环抑制率( R F I R ) ，采用流式细胞术检测T 淋巴细胞亚群比 例，采用免疫比浊法检测免疫球蛋自( I g ) 和补体( C ) ，采耀酶联
11、免疫吸附试 验( E L I S A ) 检测细胞因子干扰素- g a m m a ( I F N Y ) 和白细胞介素一4 ( I L - 4 ) 。 结果 1 1 瞄床表现：益生菌组早产儿溢盐水灌肠次数较对照组明显减少( 夕 0 0 5 ) ；益生菌组无腹泻病例发生，对照组1 例住院期间发生腹泻，两组腹泻 发生率豺检验差异无统计学意义( 胗o 0 5 ) 。 2 外瘸盘免疫学指标 2 1 红细胞免疫功能：较对照组，益生菌组R B C - C 3 b R R 、R F E R 、R F E R R F I R 明显增加( 尸 0 0 5 ) ，而王卜4 水平高于对照组( _ I 醴 人I L
12、 - 4 、I F N - Y 定量酶联免疫检测试剂盒，上海森雄科技实业有限公 司产品。 ( 3 ) 酵母多糖冰冻试剂：浓度为1Xl O “ m L ，2 - - 一3 m L 支，上海市长海医院 输血科盘液免疫研究室产品。 ( 4 ) 抗C D 3 一P E C Y 5 、C D 4 - F I T C ：C D 8 一P E 抗体，抗I g G l 一F I T C 、I g G l P E 、 I g G I - P E C Y 5 抗体，法国I M M U N O T E C H 公司产品。 5 ) 溶盘素O p t i L y s eC ，美国B E C K M A NC O U L
13、 T E R 公司产品。 ( 6 ) I m m u n o g l o b u l i nMR e a g e n t 、I m u n o g l o b u l i nGR e a g e n t 、C o m p l e m e n t C 3R e a g e n t 及C o m p l e m e n tC 4R e a g e n t ，美国B E C K M A NC O U L T E R 公司产品。 4 主要仪器 ( 1 ) E P I C SX L 流式细胞仪( B E C K M A NC O U L T E R 公司，美国) ( 2 ) 酬l l 全自动蛋自分析仪(
14、 8 E 腿至赆公司，德国) ( 3 ) S p e c t r a M a xM 2 型酶标仪( 配备S O F T m a x P r 0 4 8 数据处理程序) ( M D 公司， 美国) ( 垂) B 1 2 0 型医用低速离心机( 安新县自洋离心机厂，河北) ( 5 ) M S l 振荡器( I K A ，德国) ( 6 ) D K - 6 0 0 9 型恒温水箱( 精宏实验设备有限公司，上海) 5 免疫学指标检测 5 1 红细胞0 3 b 受体花环率和红细胞免疫复合物化环率：采用郭峰花环率法， 1 4 山东人学硕士学位论文 见参考文献3 3 6 1 啦 射。 原理：待测新鲜枸橼酸抗
15、凝血经离心后血浆含有补体成分，加入酵母菌悬 液经孵育话酵母菌可激活补体C 3 b 等补体分子，加入自身红细胞，带有C 3 b 补体 分子的酵母菌可被数量众多的红细胞C R l 黏附结合形成花环状，以此计算出的 花环率即为R B C - C 3 b R R ；红细胞膜上黏附的免疫复合物( I C ) 中C 3 b 分子或抗原 补体复合物中的C 3 b 分予可与补体未致敏的酵母菌的酵母多糖黏附形成花环， 以此计算出的花环率即为R B C - I C R 。这两种花环率的高低可作为红细胞在血循 环中天然免疫力高低的指标之一。 悬液制备：将I m L 新鲜枸橼酸抗凝股静脉血离心，4 ，3 0 0 0
16、r m i n ，5 m i n ， 留取上清液即血浆待用；将红细胞用生理盐水洗涤离心3 次，2 0 0 0 r m i n ，5 m i n ， 以细胞计数器计数并用生理盐水调配成浓度为1 2 5 1 0 7 m 乙的红细胞悬液备 用。将酵母多糖冰冻试剂剪开大翻，在3 7 。C 水浴中边融化边吹打，充分吹打分 散即为浓度l 1 0 8 m L 的酵母多糖悬液，备用。 方法：取两支小试管，第l 管加5 0 誓乙血浆和5 0 驻L 酵母多糖悬液，再加5 0 l IL 红细胞悬液，充分混匀，3 7 水浴3 0 m i n ，取出试管 J 1 2 5uL O 2 5 戊二醛轻 轻混匀，取1 2 反应液水平涂片，吹千，加甲醇固定，瑞氏法染色，光学显微 镜高倍镜下观察，红细胞呈现红色，酵母菌呈现蓝色，计数2 0 0 个红细胞，以1 个红细胞黏附有2 个或以上酵母菌者为一朵花环，算出花环率，即为R B C - - C 3 b R R ： 第2 管加5 0 婪L 红细胞悬液和5 0 # L 酵母多糖悬液充分混匀，3 7
