《去内皮冻干辐照后异体小血管的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《去内皮冻干辐照后异体小血管的实验研究（35页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、重庆医科大学 硕士学位论文 去内皮冻干辐照后异体小血管的实验研究 姓名：向东洲 申请学位级别：硕士 专业：外科学（血管外科） 指导教师：赵渝 20090401 重庆医科大学硕士研究生学位论文 去内皮冻干辐照后异体小血管的实验研究 摘要 目的：研究去内皮、冻干辐照后同种异体小血管的组织结构、物 理性能及抗原性的变化，旨在了解处理后的异体血管是否适用于血管 移植。 方法：将血管随机分为A ，B 两组；A 组为对照组，B 组为去内皮 冻干辐照处理组。光镜下观察每组血管的组织结构，电镜下观察血管 去内皮化情况，测出血管张力在达到1 5 N ，3 0 N ，4 5 N ，6 0 N ，9 0 N ，1
2、2 0 N 及1 8 0 N 时的扩张直径、伸展长度及血管在横向和纵向被拉断时所能承 受的最大拉力，并计算出血管在该张力下的横向和纵向变化率；采用 免疫组化S - P 法检测处理前后主要组织相容性复合体( M H C ) 一I I 类抗 原的表达水平。 结果：处理组组织结构保持良好，两组血管在不同张力下的横向 及纵向变化率，差异无统计学意义，P O 0 5 。两组血管在横向上被拉 断时所能承受的最大张力和在纵向上被拉断时所能承受的最大张力差 异均有显著性( P O 0 5 表3 两组血管被拉断时所能承受的最大张力( X 两 T a b 3T h em a x i m a lt e n s i
3、o nt h a tt h ev e s s e l si nc o n t r o lg r o u pa n d e x p e r i m e n t a lg r o u pc o u l de n d u r ew i t h o u tb r o k e n ( X 士s ) 注：与对照组比较，+ P O 0 1 ：+ P 0 0 5 重庆医科大学硕士研究生学位论文 第三部分去内皮冻干辐照后异体小血管抗原性的变 化 1 材料与方法 1 1 实验动物 选用重庆地区健康成年毕格犬L 2 只，雌雄各半，体重l O - - - 1 5 k g ，由重庆医科 大学实验动物中心提供( 喂养条件
4、：无菌、清洁、通风、温湿度恒定、混合饲料 笼养) 。 1 2 实验材料及药品 ( 1 ) I 型胶原酶：美国s i g m a 公司 ( 2 ) 肝素钠注射液：苏州新宝制药有限公司 ( 3 ) 速眠新：长春市军需大学兽医研究所 ( 4 ) P B S ：北京中杉金桥生物技术有限公司 1 3 实验仪器 C S 5 0 1 型电热恒温水浴箱：重庆实验设备厂 一8 0 O 超低温冰箱：S a n y oU lt r aL a wC o 冷冻干燥机：上海医用分析仪器厂 鼠抗犬删C I I 类抗体：A b DS e r o t e c 公司 免疫组织化学检测试剂盒( 抗小鼠) ：晶美生物工程有限公司 常
5、规手术器械：重庆医科大学动物外科实验中心 1 4 实验方法 1 4 1动物实验 1 4 1 1 异体血管的制备 将犬用速眠新0 1m l k g 麻醉，麻醉良好后固定于手术台上，常规消毒铺巾， 严格遵循无损伤技术，用0 8 无损伤缝线贯穿缝扎颈静脉所有分支后，将颈静脉取 下，用肝素生理盐水冲洗干净血管内血液( 图1 ) 。一端用血管夹夹住，另一端置入 留置针后用丝线结扎固定( 图2 ) ，注水观察血管有无渗漏。如有渗漏，用0 8 无损 重庆医科大学硕士研究生学位论文 伤缝线缝扎渗漏处。然后通过留置针向血管内注入0 1 I 型胶原酶至血管充盈，然 后将血管放入3 7 恒温无菌生理盐水中，消化3
6、0 r a i n ，反复3 次，完全消化掉内皮细 胞，然后将去内皮的异体血管置入- 7 0 速冻2 4 h ，- 7 0 5 州g 冷冻干燥 6 h ，C 0 2 0 0 c G y 辐照3 0 s 。以新鲜颈静脉为对照组 1 4 2 免疫水平测试 两组各截取l c m 长的1 2 段颈静脉，冷冻切片，厚5 岫，冷丙酮固定l O m i n ，3 H 。0 。一 甲醇液中浸泡t O m i n ，正常山羊血清窒温孵育l O m i n ，鼠抗犬m C I I 类抗原的单克隆 抗体普通冰箱过夜：用相应免疫组化检测试剂盒染色，制备D A B 显色液显色。以 上每步骤间均以P B S 缓冲液冲洗3
7、 X 2 m i n ：常规脱水，透明，中性树胶封片。用 V I D A S 图象处理系统处理，半定量分析处理前后的C 一1 I 类抗原水平。 1 4 3 统计学处理 所有数据采用S P S S l1 5 软件包进行统计分析。数据以均数标准差( 叉- 5 ) 表 示。采用两独立样本均数比较的t 检验。检验水准= O 0 5 。尸 0 0 5 为差异有统计 学意义 2 结果 对照组免疫组化细胞染色显示血管结构清晰，棕黄色主要表达在内弹力膜及其 血管内皮细胞，整体组织均呈淡黄色( 图t O ) 。而实验组阳性表达量明显减少( 图 1 1 ) 。处理组的删C I I 类抗原水平下降明显，与对照组相比
8、差异有显著性( P 0 0 1 ) 。( 表4 ) 表4 两组血管咖c - 1 T 类抗原水平( X 士两 T a b 4T h el e v e lo fM H CC l a s sI Ia n t i g e no ft h ev e s s e l sf r o mc o n t r o la n d e x p e r i m e n t a lg r o u p s ( X 士s ) 组别 C I I 对照组 实验组 0 2 9 6 3 0 0 1 0 4 0 2 0 5 6 0 0 0 9 0 注：与对照组比较，P O O t 1 4 重庆医科大学硕士研究生学位论文 全文讨论 1
9、异体血管制备： 由于供体和受体之间的组织相容性抗原的不同，异体生物材料若不经处理， 移植后将出现免疫排斥反应。即使在组织配型和A B O 血型相合的情况下，后期也有 可能发生慢性排斥反应。全身血管组织结构构成比例各不相同，主动脉含弹力纤维多， 股动脉和股静脉含平滑肌比例大，颈动脉含胶原多1 。一般认为异体血管移植物的胶 原无抗原性，弹力纤维、肌层和内皮细胞是有抗原性的。其中内皮细胞是其抗原性的 主要来源，血管的抗原性主要存在于内皮细胞中赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸等残 基H 1 。血管内皮细胞是供受者细胞间最早接触的部位，也是最早被受者免疫系统所 识别的供体细胞。内皮细胞的抗原有A B O 抗原、
10、M H C I 、I I 类抗原、内皮细胞特异性抗 原阳3 ，其不仅表达抗原而且还通过抗原提呈、表型变化、细胞因子合成来参与免疫 反应，成为排斥反应的主要靶细胞。另外研究表明血管平滑肌细胞也表达c l a s sI 、 I I 等抗原系统，参与免疫排斥反应。免疫反应造成内膜增生、中膜坏死和外膜侵润， 排斥反应的最终结果是移植物狭窄、闭塞睁旺和血栓形成等，最终使移植物失去功能。 文献报道，异体血管处理方法很多，如低温冷冻、冷冻干燥、辐照、戊二醛、多聚环 氧化物、甘油等。研究表明，低温保存选择性地抑制了同种异体抗原呈递细胞，即 移植动脉内的过路细胞，造成动脉免疫源性降低3 1 ：但是冷存时间越长，
11、对血管内皮 的损害越大n 村：V e s e l y n 5 1 等认为冷冻干燥技术无损于胶原纤维和粘多糖的物理性能。 V e s e l y 在同种异体血管移植中，血管经冻干辐射，移植后六个月行组织学观察，其 结构未发生明显变化，抗原性微弱，宿主免疫反应轻，同种异体血管内膜完整无损， 血管弹性纤维和胶原纤维数目正常，仅有轻微外膜炎症反应，与自体血管移植相似。 张培华等报道，将异体血管一7 0 低温速冻2 4 d , 时，一7 0 5 硝g 冷冻干燥6 4 , 时，封 装：C 0 2 5 1 0 6 R a d 辐照处理后，观察到免疫排斥反应可降 氐8 5 - - 9 5 。但是射线 照射可引
12、起体内体外血管内皮细胞形态结构的明显的损伤性变化，如胞浆小泡增多， 细胞空泡样变性，染色体断裂，核固缩和D N A 合成抑制，细胞停止分裂增长。戊二醛 等醛化剂渗入组织使蛋白质、胶原分子之间形成交联，能增加管壁强度和掩盖抗原部 位不产生H L A 等抗体，形成一层致密而又连续的内弹性膜，显示有良好的血液相容性。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 但血管壁残留醛基的毒性使宿主细胞不能移入移植物n 制，导致移植物硬化、钙化、耐 久性差，影响远期通畅率n 引，同时对其产生动脉瘤、内膜不规则、吻合口狭窄等并发 症的研究发现，移植后血管顺应性、杨氏模量等机械性能差异很大，也说明醛化脐静 脉由于生物活性降低
13、和组织退化并发症也自然增多。多聚环氧化物处理后相对于醛化 来说具有低毒、亲水性使得受体内皮细胞更容易在交联后的血管表面生长，平滑肌细 胞和纤维母细胞_ J 丁以更早的移行人血管壁内促进血管壁重构n 引。 本研究将异体血管的内皮细胞消化掉，并经冻干辐照处理，组织结构保存完 好且抗原性大大降低。笔者制作异体血管的体会是：使用胶原酶消化血管内皮 细胞时现用现配，配置的浓度为0 1 ；异体血管取材后用肝素生理盐水冲洗干净 血管内血液，一端用丝线结扎，另一端置入留置针后亦用丝线结扎，注水观察血管有 无渗漏。如有渗漏，用o 8 无损伤缝线缝扎渗漏处：然后通过留置针向血管内注入 0 1 I 型胶原酶至血管充
14、盈，然后将血管放入3 7 恒温无菌生理盐水中，消化3 0 r a i n ， 反复3 次，直至异体血管呈乳白色，然后用肝素生理盐水反复冲洗：异体新鲜血管 取下后要将血管的外膜修剪掉。 2 物理性能测试： 研究表明，血管的物理特性在血管移植后保持远期高通畅率中发挥重要作用： 物理性能较差的异体血管植入具有正常物理性能的宿主血管时，将引起血流动力 学的变化。表现在：连接处由于不同的管壁弹性造成不同的压力波传播率，引起 波的反射并形成涡流，容易导致血液凝结和细胞内壁增殖n 一】：由于移植血管和宿 主血管的直径膨胀率不同，在吻合处将会有过多的应力产生，导致吻合处产生缝 合线的疲劳、宿主血管产生剪切力，
15、并产生纤维组织。为得到良好的压力传递而 不产生反射效应，移植后的血管必须与宿主血管有相同的管道。因此，物理性能 的匹配是异体血管生物动力学性能中的一个重要部分。 本研究表明随着血管受到的张力的变化，经过去内皮、冻干辐照处理后血管的 横向和纵向变化逐渐增大；在正常生理范围内，处理组血管的物理特性和正常血 管之间无明显差异，可以推测经处理后的血管不会因为物理特性的关系而影响血 流，也就不会因为物理特性的变化而引起血管移植后狭窄。因此，就血管物理特 性而言，处理组的血管适合作为一种血管移植替代物。 1 6 重庆医科大学硕士研究生学位论文 3 免疫原性测试： 在提高异体血管移植远期通畅率中，不仅要保持
16、异体血管和宿主血管物理性 能的一致，同时还要降低异体血管的抗原性。血管内皮细胞层是由菲薄的扁平形 细胞汇合而成的，它覆盖在所有血管的内表面，是与血液之间的理想界面，是供、 受者细胞间最早接触的部位，也是最早被受者免疫系统所识别的供体细胞。冻二F 处理可使部分M H C 抗原决定簇被封闭，从而降低异体血管的抗原性。辐照能较好 地保存血管结构，灭菌并能阻止病毒的传播n 们并可通过改变蛋白的空间构象减少 血管M H C I ，I I 类抗原的表达，有效地降低血管的抗原性。C a t t r a l 等旺们通过小鼠 异基因移植表明，冷冻处理的移植物，因在冻融过程中使部分M H C 抗原决定簇封 闭而减少抗原的表达。运用冻干技术可使移植血管M H C I 类和I I 类抗原表达减少 7 0 。R a m a n 等眨对兔耳缘一股静脉异体移植的研究表明，通过辐射处理可改变 移植物抗原的蛋白质空间构象，从而减少抗原的表达。单纯辐射处理可使移
