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1、山东大学 硕士学位论文 原花青素对脂多糖引起的人血管内皮细胞损伤的保护作用 姓名：雷雪明 申请学位级别：硕士 专业：病原生物学 指导教师：周亚滨 20090320 山东大学硕士学位论文 原花青素对脂多糖引起的人血管内皮细胞损伤的保护作用 专业： 硕士研究生： 导师： 病原生物学 雷雪明 周亚滨副教授 中文摘要 目的 动脉粥样硬化( A t h e r o s c l e r o s i s ，A S ) 严重威胁人类健康，是发达国家人口 死亡的主要原因，在我国A S 的发病率也呈逐年增高的趋势。血管内皮细胞 ( v a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l
2、 l ，V E C ) 的损伤及功能障碍被认为是A s 形成的开始。 内毒素是动脉粥样硬化的诱因之一。它是革兰阴性菌细胞壁外膜的结构成分之 一，其化学本质为脂多糖( 1 i p o p o l y s a c c h a r i d e ，L P S ) 。不同种属的G 一杆菌具有相同 的L P S 基本骨架，即由O 特异性多糖、非特异性核心多糖和脂质A ( 1 i p i dA ) - - 部分组 成，其中脂质A 为其毒性中心。血管内皮细胞是内毒素以及众多细胞因子作用的 主要靶细胞，脂多糖通常通过直接或间接两条途径作用于血管内皮，造成细胞的 过强反应，细胞出现形态和功能改变。直接损伤是脂多糖
3、通过促使单核细胞、中 性粒细胞及T 淋巴细胞等与血管内皮细胞相结合，通过释放蛋白酶及氧自由基直 接损伤V E C 。脂多糖亦可通过体液免疫反应间接损伤V E C ，加速了A S 的发生与 发展。 原花青素( P r o a n t h o c y a n i d i n s ，P C ) 是一类在植物中广泛存在的多酚化合物，是 存在于植物体内的天然抗氧化物。原花青素具有多种生物活性、药理作用和临床 疗效，如极强的抗氧化活性，清除氧自由基，抗非酶糖基化、内皮依赖性血管舒张 活性、抗缺血再灌注损伤、抗炎、抗血小板聚集、免疫调节等。原花青素可对多 种蛋白酶有强大的抑制作用，即可通过酶抑制活性保护血管
4、。葡萄籽原花青素提 取物( g r a p es e e dp m a n t h o e y a n i d i ne x t r a c t ，G S P E ) 目前研究最多，其中原花青素含 量可高达9 5 。 山东大学硕士学位论文 本实验在脂多糖刺激V E C 中，加以原花青素的干预。检测原花青素能否抑制 脂多糖引起的细胞凋亡，以及凋亡相关基因的表达变化。这可为开发干预内皮细 胞炎症反应的抗A s 新药提供一条新思路。 方法 1 人血管内皮细胞培养 培养人血管内皮细胞并鉴定，待细胞呈亚单层状态，按常规方法进行传代， 取生长状态好的单层内皮细胞，进行实验。 2 实验分为四组： 对照组：用
5、含1 0 血清的D M E M 培养基培养V E C 细胞。 ( g ) L P S 组：含1 0 血清的培养基中加入L P S ，使其浓度为含l u g m l ，培养V E C 。 L P S + 低浓度原花青素( P C ) 组：含1 0 血清的培养基中加入L P S 和P C 共 同作用V E C 细胞，L P S 的最终浓度是l u g m l ，低浓度P C 的最终浓度是l O m g m l ， 培养V E C 。 L P S + 高浓度原花青素( P C ) 组：含1 0 血清的培养基中加入L P S 和P C 共 同作用V E C 细胞，L P S 的最终浓度是l u g m
6、 l ，高浓度P C 的最终浓度是2 0 m g m l ， 培养V E C 。 将上述处理的细胞，置3 7 。C 5 C 0 2 孵箱，继续培养2 4 h 。 3 采用四甲基偶氮唑盐( M T T ) E L 色法检测原花青素对脂多糖损伤的血管内 皮细胞增殖活性的影响。用酶标仪测定每孔光密度值，测定波长为4 9 0 n m ，计算细 胞增殖率。( 细胞增殖率：( 处理组O D 值空白组O D 值) 空白组O D 值1 0 0 ) 。 4 用A n n e x i n - v P I 法处理各组细胞，并使用流式细胞仪定量检测各组细胞的 凋亡率。 5 用T r i z o l 提取细胞总R N
7、A ，逆转录合成c D N A ，应用实时荧光定量P C R 检 澳J C a s p a s e3m R N A 的表达情况，通过测定循环阈值( C t ) 显示C a s p a s e3m R N A 的表达量，以卢a c t i o n 作为参照，基因表达的相对变化以R Q 值表示。 6 用T r i z o l 提取细胞总R N A ，逆转录合成c D N A ，应用实时荧光定量P C R 检 i 贝I B C L 2m R N A 、B A Xm R N A 的表达情况，通过测定循环阈值( C t ) 显示B C L 2 m R N A 、B A Xm I 矾A 的表达量，以f l
8、 - a c t i o n 作为参照，基因表达的相对变化以R Q 值表示。 2 山东大学硕士学位论文 结果 1 免疫组织化学证实人血管内皮细胞培养成功； 2 M T T 的结果显示：脂多糖明显地减弱了血管内皮细胞的增殖活性，而再 加入低，高两种浓度的原花青素干预后均可明显地增强血管内皮细胞增殖活性。 3 流式结果显示：脂多糖明显地减弱了血管内皮细胞的增殖活性，原花青 素可以有效抑制脂多糖引起的内皮细胞的凋亡。 4 实时荧光定量P C R 结果显示：L P S 可引起C a s p a s e 一3m R N A 表达上调而用 不同浓度原花青素干预脂多糖处理组后细胞C a s p a s e
9、一3m R N A 的表达呈现降低趋 势。 5 我们的研究显示：l u g m l 脂多糖刺激血管内皮细胞2 4 h 后，其B c l - 2m R N A 的表达明显降低，B a xm R N A 的表达明显升高，B c l 2 B a x ! ：I “ , 值明显下降，与对照 组相比均有统计学意义( 尸 O 0 5 ) 。而在1 0 m g m l 和2 0 m g m l 两种不同浓度的原 花青素干预脂多糖处理组后其B c l 2m R N A ，B a xm R N A ，B c l 2 B a x l ：匕值的变化 恰恰与L P S 组的变化相反，与L P S 组比较均有统计学意义(
10、 尸 5 0 p g m l 的被调 查者中，5 年后动脉粥样硬化的发生率比其他被调查者高3 倍。大量研究表明，脂 多糖参与动脉粥样硬化的形成过程，特别是动脉粥样硬化血管炎症的初始过程， 脂多糖可通过直接或间接的方式激活并损伤内皮细胞，引起血管内皮细胞形态与 功能的改变【，1 2 J 。 原花青素( p r o a n t h o c y a n i d i n s 或p r o c y a n i d i n s ，简称P C ) 是植物中广泛存在的 一大类多酚化合物的总称。多年来人们对从众多不同植物中提取出的P C 进行了 大量研究，作为P C 的来源，葡萄籽原花青素提取物( G r a
11、p es e e dp r o a n t h o c y a n i d i n s e x t r a c t ，G S P ) 得到了最为深入和广泛的关注。G S P 是由不同数量的儿茶素或表儿 茶素聚合而成。最简单的原花青素是儿茶素与表儿茶素形成的二聚体，此外还有 三聚体、四聚体等直至十聚体【1 3 】。G S P 的生物学效应具有如下特点：( 1 ) 抗氧化 活性和清除自由基：原花青素具有极强的抗氧化活性，是一种良好的氧游离基清 除剂和脂质过氧化抑制剂。( 2 ) 心血管保护作用：动物实验和临床研究发现，原 花青素可以有效地降低胆固醇和低密度脂蛋白水平，预防血栓形成，有助于预防 心脑
12、血管疾病的发生。原花青素可以捕获水溶性物质中的活性氧，清除自由基， 抑制低密度脂蛋白的氧化，从而表现出抗动脉粥样硬化的活性。( 3 ) 抗肿瘤作用： 原花青素对多种肿瘤细胞( 如乳腺癌、前列腺癌、皮肤癌细胞等) 都具有不同程 9 山东大学硕士学位论文 度的抑制作用。其作用机制可能与调节有丝分裂、阻滞细胞周期、抑制细胞生长 及诱导细胞凋亡等作用有关。( 4 ) 抗突变作用：原花青素的抗致突变活性可归因 于它的抗氧化剂活性【1 4 1 。( 5 ) 抗炎活性：炎症发生时，原花青素可降低炎性介质组 胺、缓激肽等引起的毛细血管通透性增高，从而改善毛细血管的抵抗力和通透性， 减少毛细血管壁的脆性，使毛细
13、血管的张力和通透性减小，保护毛细血管的物质 转运能力。( 6 ) 其他生物学作用；此外，原花青素还具有抗辐射、延缓衰老、减 轻水肿、降低毛细血管通透性、抑制酶活性、保护肝脏、抗病毒、抗真菌活性、 改善视疲劳、促进毛发生长等功效，对治疗外周静脉功能不全、眼科疾病以及淋 巴水肿等疾病均有很好的疗效【1 5 1 6 l 。G S P 使用时几乎无任何副作用，已成为目 前研究和开发的一大热点，并将在预防和治疗疾病中发挥越来越大的作用。 近几年研究发现，在动脉粥样硬化斑块形成的过程中，存在血管内皮细胞凋 亡现象，并反过来参与和加速动脉粥样硬化进程。另外，损伤学说认为脂多糖参 与动脉粥样硬化的形成过程，特
14、别是动脉粥样硬化血管炎症的初始过程，脂多糖 可通过直接或间接的方式激活并损伤内皮细胞。 为此我们提出如下假说：原花青素通过抗氧自由基抑制内皮细胞的凋亡，从 而具有保护内皮细胞的作用。为此，我们进行了研究，首先体外观察脂多糖对血 管内皮细胞的损伤，然后探讨原花青素对脂多糖引起内皮细胞损伤的保护及其作 用机制，并为临床治疗提供客观的理论依据。本实验分为三个部分，第一部分为 原花青素干预脂多糖引起的血管内皮细胞损伤的研究，第二部分为原花青素对脂 多糖诱导的血管内皮细胞C a s p a s e 3 表达的影响，第三部分为，原花青素对脂多 糖诱导的血管内皮细胞B c l 一2 和B a x 表达的影响
15、。 l O 山东大学硕士学位论文 第一部分原花青素干预脂多糖引起的血管内皮细胞 损伤的研究 本课题第一部分首先建立脂多糖致血管内皮细胞凋亡的模型，其后用原花青 素进行干预，探讨其对内皮细胞的保护作用。 材料和方法 一、实验材料 1 1 细胞、脂多糖和原花青素 人血管内皮细胞，由山东大学医学院微生物实验室提供；脂多糖( L P S ) 和 原花青素购于S i g m a 公司 1 2 仪器 各型号细胞培养板、细胞培养瓶 C o s t a r 公司 二氧化碳培养箱Heraeus公司 电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司 蒸汽消毒器山东新华医疗器械厂 荧光倒置显微镜N i k o n 公司
16、倒置显微镜、普通显微镜O L Y M P U S 公司 超低温冰箱日本三洋电器 H FS a f e 生物安全柜上海力申科学仪器有限公司 数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司 微量移液器 G i l s o n 和E p p e n d o r f 公司 G X 2 型智能光照培养箱宁波江南仪器厂 T H I C 恒温振荡器江苏太仓市实验设备 立式自动电热压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂 电子天平上海天平仪器厂 M i n i 离心机 E p p e n d o r 铲品 台式离心机上海安亭科学仪器厂产品 数显电热恒温水浴箱上海跃进医疗器械厂产品 台式高速冷冻离心机 E p p e n d o r f 产品 自动双蒸水蒸馏器上海玻璃仪器厂产品 山东大学硕士学位论文 冰箱 D Y I I l 3 0 A 型高速低温离心机 圆底流式离心管 一次性无菌针头滤器( 0 2 2 u m ) B I O R A D6 8 0 酶标仪 F C 5 0 0 流式细胞仪 1 3 试剂及其配制
