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1、PCR 技术的种类及其应用 1 PCR 技术的基本原理PCR 技术是在模板DNA、引物和四种dNTP等存在的条件下, 依赖于DNA聚合酶(T aq 酶)的酶促合成反应。其具体反应分三步：变性、退火、聚合。以上三步为一个循环， 每一循环的产物DNA又可以作为下一个循环模板，数小时后，介于两个引物之间的目的DNA得到了大量的复制，经2530次循环DNA数量可达21067拷贝数。2PCR技术的种类2.1 反向PCR( Inverse PCR, IPCR)技术原理：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组I)NA后酶切片段自身环化以环化的DN
2、A作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段 。该方法的不足是：需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。2.2锚定PCR(Anch
3、ored PCR, APCR)技术用酶法在一通用引物反转录cDNA3-末端加上一段已知序列, 然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增, 称为APCR。应用：它可用于扩增未知或全知序列, 如未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。2.3不对称PCR(asymmetric PCR)技术两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度, 常用501001比例。在最初的1015个循环中主要产物还是双链DNA, 但当低浓度引物被消耗尽后, 高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。应用：可制备单链DNA片段用于序列分析或核酸杂交的探针。2.4反转录
4、PCR(reverse transcription, RT- PCR)技术当扩增模板为RNA时, 需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。RT - PCR应用非常广泛, 无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。2.5修饰引物PCR技术为达到某些特殊应用目的, 如定向克隆、定点突变、体外转录及序列分析等, 可在引物的5-端加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序列分析结合位点等 。2.6巢式PCR(NEST PCR)技术先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量, 然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR带, 此为巢式PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。为减少巢式PCR的操
5、作步骤可将外引物设计得比内引物长些, 且用量较少, 同时在第一次PCR时采用较高的退火温度而第二次采用较低的退火温度, 这样在第一次PCR时, 由于较高退火温度下内引物不能与模板结合, 故只有外引物扩增产物, 经过若干次循环, 待外引物基本消耗尽, 无需取出第一次PCR产物, 只需降低退火即可直接进行PCR扩增。这不仅减少操作步骤, 同时也降低了交叉污染的机会。这种PCR称中途进退式PCR( drop-in, drop-out PCR)。上述三种方法主要用于极少量DNA模板的扩增。2.7等位基因特异性PCR(Allele- specificPCR, ASPCR)技术ASPCR依赖于引物3- 端
6、的一个碱基错配,不仅减少多聚酶的延伸效率,而且降低引物-模板复合物的热稳定性。这样有点突变的模板进行PCR扩增后检测不到扩增产物,可用于检测基因点突变。2.8单链构型多态性PCR(single- strandconformational polymorphism PCR, SSCPPCR)技术SSCP- PCR是根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中,单链DNA迁移率除与DNA长度有关外,更主要取决于DNA单链所形成的空间构象, 相同长度的单链DNA因其顺序不同或单个碱基差异所形成的构象就会不同,PCR产物经变性
7、后进行单链DNA凝胶电泳时, 每条单链处于一定的位置,靶DNA中若发生碱基缺失、插入或单个碱基置换时,就会出现泳动变位,从而提示该片段有基因变异存在。2. 9低严格单链特异性引物PCR (Lowstringencysingle specific primer PCR, LSSP- PCR)技术LSSP - PCR 是建立在PCR 基础上的又一种新型基因突变检测技术。要求是“二高一低”, 高浓度的单链引物( 5- 端/ 3- 端引物均可),约4. 8Lmol,高浓度的Taq 酶( 16Lmol/ 100ml) , 低退火温度( 30),所用的模板必须是纯化的DNA片段。在这种低严格条件下, 引物
8、与模板间发生不同程度的错配, 形成多种大小不同的扩增产物, 经电泳分离后形成不同的带型。对同一目的基因而言, 所形成的带型是固定的, 因而称之为“基因标签”。这是一种检测基因突变或进行遗传鉴定的快速敏感方法。2.10复合PCR(multiplex PCR)技术在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段,如果基因的某一区段有缺失,则相应的电泳谱上这一区带就会消失。复合PCR主要用于同一病原体的分型及同时检测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断。2.11重组PCR技术重组PCR技术是在两个PCR扩增体系中, 两对引物分别由其中之一在其5-端和3-端引物上带上一段互补的序列,混合两种PCR扩增产物,
9、经变性和复性,两组PCR产物互补序列发生粘连,其中一条重组杂合链能在PCR 条件下发生聚合延伸反应,产生一个包含两个不同基因的杂合基因。2.12随机引物扩增技术(arbitrary primedPCR, AP- PCR)AP-PCR技术通过随意设计或选择一个非特异性引物,在PCR反应体系中,首先在不严格条件下使引物与模板中许多序列通过错配而复性。如果在两条单链上相距一定距离有反向复性引物存在,则可经Taq酶的作用使引物延伸而发生DNA片段的扩增, 经一至数轮不严格条件下的PCR循环后,再于严格条件下进行扩增。扩增的产物经DNA测序凝胶电泳分离后,经放射性自显影或荧光显示即可得到DNA指纹图。A
10、P-PCR用于肿瘤的抑制基因、癌基因的分离；菌种、菌株及不同物种的鉴定；遗传作图；不同分化程度或某些不同状态下的组织的基因表达差异等方面的研究。2.13 差示PCR (differential PCR, d -PCR)技术d-PCR可以定量检测标本靶基因的拷贝数。它是将目的基因和一个单拷贝的参照基因置于一个试管中进行PCR扩增。电泳分离后呈两条区带,比较两条区带的丰度,或在引物5- 端标记上放射性核素后,通过检测两条区带放射性强度即可测出目的基因的拷贝数。2.14定量PCR(quantitative PCR, qPCR)技术qPCR技术是用合成的RNA作为内标来检测PCR扩增目的mRNA的量,
11、涉及目的mRNA和内标用相同的引物共同扩增,但扩增出不同大小片段的产物,可容易地电泳分离。一种内标可用于定量多种不同目的mRNA。qPCR可用于研究基因表达,能提供特定DNA基因表达水平的变化,在癌症、代谢紊乱及自身免疫性疾病的诊断和分析中很有价值。2.15 竞争性PCR(competitive PCR, c-PCR)技术c-PCR技术是竞争cDNA模板与目的cDNA 同时扩增,使用同样的引物,但一经扩增后, 能从这些目的cDNA区别开来。通常使用突变性竞争cDNA模板,其序列与目的cDNA序列相同,不过模板中仅有一个新内切位点或缺少内切位点,突变性的cDNA 模板可用适当的内切酶水解,并用分
12、光计测定其浓度。cDNA目的序列和竞争模板相对应的含量,可用溴化乙锭染色,电泳胶直接扫描进行测定,或掺入放射性同位素标记的方法测定。竞争模板开始时的浓度是已知的,则cDNA目的序列的最初浓度就能测定。这种方法能精确测定mRNA中cDNA靶序列,可用于几个到10个细胞中mRNA 的定量。2.16半定量PCR(semiquantitative PCR,sq- PCR)技术sq-PCR不同于c-PCR的是参照物ERCC-2的PCR产物与目的DNA的PCR产物相似,并分别在试管中扩增。sq- PCR的流程为样品和内参照RNA分别经反转录为cDNA,然后样品cDNA和一系列不同量参照cDNA分别在不同管
13、进行扩增, PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳拍照,光密度计扫描,作出标准曲线,通过回归公式便可定量表达的基因量。虽然管与管之间的扩增效率难以控制,但由PCR扩增的所有样本和参照物在不同的实验中差异很小。这种敏感的技术可用于其他低表达的基因定量2.17原位PCR( in situ PCR)技术原位PCR综合了PCR 和原位杂交( Insitu hybridization, ISH) 的优点,是一种在组织切片或细胞涂片上原位对特定的DNA或RNA进行扩增,再用特异性的探针原位杂交检测。原位PCR标本一般需先经化学固定,以保持组织细胞的良好形态结构。细胞膜和核膜有一定的通透性,PCR扩增所需的各种成分可
14、进入细胞内或核内,在原位对特定的DNA或RNA进行扩增。扩增产物由于分子量较大或互相交织, 不易透过细胞膜向外弥散, 故保留在原位。这样就很容易应用ISH将其检出,同时还可对目的DNA序列的组织细胞进行形态学分析。2.18免疫PCR(immuno PCR)技术抗原-抗体反应与PCR技术的结合产生了免疫PCR，是目前为止最为敏感的检测方法,理论上可测到一个抗原分子的存在。通过用一个具有对DNA和抗体双重结合活性的连接分子,使作为标记物的DNA分子特异地结合到Ag- Ab复合物上，从而形成Ag- Ab- DNA复合物，附着的DNA标记物可用适宜的引物进行PCR扩增。特异性PCR产物的存在证明DNA
15、标记物分子特异地附着于Ag - Ab复合物上，进而证明有Ag存在。吴自荣等将Ab通过化学交联剂直接连接到分子上构建成Ab-DNA探针,组成免疫PCR检测新模式，具有高度灵敏和特异性。免疫PCR可对流行性传染病( 如肝炎、爱滋病等)进行检测，检测体液中致癌基因和癌基因表达的微量蛋白等。2.19长片段PCR(long-PCR)技术长片段PCR是用高质量模板DNA保证其完整性,引物应较长( 2134bp)，使用高的退火温度及错配率更低的酶，将无3-5外切酶活性的DNA聚合酶和低浓度有3- 5外切酶活性的DNA聚合酶组合使用，缓冲体系通过提高Tris的浓度或改用Tricine缓冲液以增强缓冲能力，并调
16、高体系的pH。热循环参数总的来说需增加延伸时间，一般1kb/ min，同时采用热启动。长片段PCR在限制性片段多态性及单体型分析、染色体基因步移、DNA序列分析及基因突变的鉴定等方面得到应用。3 PCR技术的应用3.1 PCR技术在农业中的应用3.1.1 PCR在转基因产品检测中的应用目前，相关研究人员已经利用PCR技术成功建立了检测转基因马铃薯、大豆和玉米的技术路线，对转基因大豆和玉米的检测低限分别到达了1和0.1。3.1.2 PCR在研究植作物生长发育方面的作用植物的生长、发育、分化和衰老都涉及许多基因的时空顺序表达，因此研究这个过程中基因表达的变化是揭示生长发育机理的重要手段。定量RT-PCR是研究植物基因表达水平变化的一项重要技术。通过研究不同植物或同意植物不同发育时期的基因表达水平
