PCR反应体系中各种成分的作用资料

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1、PCR 反应体系中各种成分的作用 不同模板浓度的实验结果 用相同的引物、两种不同的模板,对 6 种不同模板量进行 扩增,发现在模板量200时, 会出现大片段扩增产物的缺失或无扩增产物,且点样孔至泳道会出现 相应增强的弥散背景。综合考虑,在 25 的反应体系中,模 板以 25100为最适用量。同时模板在 200以 下不影响扩增结果,但为降低缓冲液中对反应体系中 2+的不良影响程度,应该尽量降低模板用量。 不同2+浓度时实验结果 设置不同2+浓度,当2+浓度为 1 0时,无扩增 产物;2+浓度为 1 52 5时,随着2+浓度的增加, 扩增产物带型基本一致,但以 2 02 0的扩增效果最好 不同引物

2、浓度对结果的影响 设置 5 种不同浓度的引物进行扩增,当引物浓度在 0 10 2 时,扩增结果基本一致;但随着引物浓度的逐渐增加,开始出现 弥散背景增强的趋势,并且有些扩增带发生减弱或缺失。为了保证反 应结果的稳定性和特异性,引物浓度以 0 0 . .2 2 左右为宜左右为宜。 不同浓度对结果的影响 采用 2 种引物(17、16),分别以 4 种不同的 浓度进行反应,发现浓度在 100 、 150 、 200 、 300 时,随着浓度的减小,扩增带明显减少或扩增强度减弱, 当浓度200 时,扩增产物丰富、清晰、带浓,扩增片段产 率与浓度呈正相关。综合考虑,以以 1 10000200200 的的

3、 浓度为佳。浓度为佳。 聚合酶对扩增结果的影响 设置 5 个梯度的聚合酶浓度,结果表明随着 聚合酶浓度的增高,扩增产物量呈增多趋势。在 0 52 5 浓度间均有扩增产物,但随着聚合酶浓度增加的同时, 弥散背景也相应增强。综合考虑,聚合酶浓度以 1 1 0 01 1 5 5结果较好 不同退火温度下的扩增效果 引物用16和01,按照优化的反应体系将退火 温度分别设置为 33、36、39、42。结果表明随着退火温度 降低,非特异性产物增加,有弥散背景;退火温度升高退火温度升高, ,特异性相对增特异性相对增 加。加。 2 与互相作用及对反应的影响 用 同一引物07、相同模板比较 3 种 2 浓度与 3

4、 种浓度完全随机相结合的 9 个处理的结果,研究了 2 与的相互作用。结果表明,2 在低浓度时, 过量的对2+的螯合作用明显,表现为降低2+的酶催 作用,扩增产物减少或无,而低量的对2+酶催的 抑制作用减少,扩增产物增多。在高浓度2 浓度下, 无抑制作用。在相同2+离子浓度和足量时,扩增 产物相似。1-9 泳道分别代表2()/( )的浓 度(1/100、1/200、1/300、2/100、2/200、2/300、3/100、3/200、 3/300)。 PCR 反应体系与反应条件 标准的 PCR 反应体系： 10扩增缓冲液 10ul 4 种 dNTP 混合物 各 200umol/L 引物 各

5、10100pmol 模板 DNA 0.12ug Taq DNA 聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul PCR 反应五要素： 参加PCR 反应的物质主要有五种即引物、 酶、 dNTP、 模板和 Mg2+ 引物： 引物是 PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决 于引物与模板 DNA 互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板 DNA 序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用 PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则： 引物长度： 15-30bp，常用为 20bp 左右。 引物扩增跨度： 以 200-500bp 为宜，

6、特定条件下可扩增长至 10kb 的片段。 引物碱基：G+C 含量以 40-60%为宜，G+C 太少扩增效果不佳， G+C 过多易出现非特异条带。 ATGC 最好随机分布， 避免 5 个以上的嘌 呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 避免引物内部出现二级结构， 避免两条引物间互补， 特别是特别是3 3 端的互补端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 引物引物 3 3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要 求求配对，配对，以避免因末端碱基不配对而导致 PCR 失败。 引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适 宜的酶切位点，

7、这对酶切分析或分子克隆很有好处。 引物的特异性： 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同 源性。 引物量： 每条引物的浓度 0.11umol 或 10100pmol，以最低 引物量产生所需要的结果为好， 引物浓度偏高会引起错配和非特异性 扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 酶及其浓度 目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应， 一种是从栖热 水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。 催化 一典型的 PCR 反应约需酶量 2.5U(指总反应体积为 100ul 时)，浓度 过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP 的质量与浓度 dNTP 的质量与浓度和 P

8、CR 扩增效率有密切 关系，dNTP 粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP 溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以 1M NaOH 或 1M Tris。HCL 的缓冲液将其 PH 调节到 7.07.5，小量分装， -20冰冻保存。多 次冻融会使 dNTP 降解。在 PCR 反应中，dNTP 应为 50200umol/L， 尤其是注意 4 种 dNTP 的浓度要相等( 等摩尔配制)， 如其中任何一种 浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会 降低 PCR 产物的产量。 dNTP 能与 Mg2+结合， 使游离的 Mg2+浓度降低。 模板(靶基因)核酸 模板核酸的

9、量与纯化程度， 是 PCR 成败与否 的关键环节之一， 传统的 DNA 纯化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 来消 化处理标本。SDS 的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质， 因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白， SDS 还能与 蛋白质结合而沉淀；蛋白酶 K 能水解消化蛋白质， 特别是与 DNA 结合 的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用 乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于 PCR 反应。一 般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消 化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于 PCR 扩增。RNA 模板 提取一般采

10、用异硫氰酸胍或蛋白酶 K 法，要防止 RNase 降解 RNA。 Mg2+浓度 Mg2+对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响，在一 般的 PCR 反应中， 各种 dNTP 浓度为 200umol/L 时， Mg2+浓度为 1.5 2.0mmol/L 为宜。 Mg2+浓度过高， 反应特异性降低， 出现非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反应产物减少。 PCR 扩增时建议在混合物上面铺一层石蜡油，减少 PCR 过程中尤 其是变性时液体蒸发所造成的产物的丢失。 研究表明，应用石蜡油可 使扩增产量增加 5 倍， 可能与石蜡油维持热恒定和整个反应体系中盐 浓度有关。 尿嘧

11、啶DNA糖基酶（UDG） 就是在pre-PCR阶段用 dUTP 替代 dTTP， UDG存在于反应混合液中， 其它所有反应成分保持不变。PCR 反应的 DNA 链延长过程中 DNA 聚合 酶用 dU 代替了 dT，因而产物 DNA 序列中含有 dU 而不是 dT，在新样 品进行反应前， 它们首先面临的是 UDG。 含有U的DNA链一旦遇上UDG， 这些 U 就会被切除而使该链具有缺刻。在接下来的 PCR 加热过程中， 有碱基缺失的 DNA 链分开后不能够被扩增。因此，UDG 的使用赋予热 启动一个额外的优点就是它能降解第一轮完整的循环之前形成的所 有 PCR 产物。 TaqDNA 聚合酶 Ta

12、q DNA聚合酶是从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1 株分 离提取的.yT 是 一种嗜热真菌，能在 7075生长.该菌是 1969 年 从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离的。该酶基因全长 2496 个 碱基，编码 832 个氨基酸，酶蛋白分子为 94KDa.其比活性为 200000 单位/mg.7580时每个酶分子每秒钟可延伸约 150 个核苷 酸，70 延伸率大于 60 个核苷酸/秒， 55时为 24 个核苷酸/秒.温度过高(90 以上) 或过低(22)都可影响 Taq DNA 聚合酶的活性，该酶虽然在 90以上几乎无 DNA 合成， 但确有良好的热稳定性，在 PC

13、R 循环的 高温条件下仍能保持较高的活性.在 92.5、95 、97.5时，PCR 混合物中的 Taq DNA 聚合酶分别经 130min，40min 和 56min 后，仍 可 保持50%的活性， 实验表明.PCR 反应时变性温度为9520sec， 50 个循环后，Taq DNA 聚合酶仍有 65%的活性.Taq DNA 聚合酶的热稳 定性是该酶用于 PCR 反应的前提条 件，也是 PCR 反应能迅速发展和 广泛应用的原因.Taq DNA 聚合酶还具有逆转录活性， 其作用于类似 逆转录酶.此活性温度一般为 6568，有 Mn2+存在时， 其逆转录活 性 更高. TaqDNA 聚合酶是 Mg2

14、+依赖性酶，该酶的催化活性对 Mg2+浓度非 常敏感.以活性程度 很低的鲑鱼精子 DNA 为模板，dNTP 的浓度为 0.70.8mmol/L 时，用不同浓度 Mg2+进行 PCR 反应 10min，测定结 果为 Mgcl2 浓度在 2.0mmol/L 时该酶催化活性最高，此浓度能最 大 限度地激活 TaqDNA 聚合酶的活性， Mg2+过高就抑制酶活性， 当 Mgcl2 浓度在 10mmol/L 时可抑制 4050%的酶活性.由于Mg2+能与dNTP 结 合而影响 PCR 反应液中游离 的 Mg2+浓度，因而 Mgcl2 的浓度在不同 的反应体系中应适当调整，优化浓度.一般反应 中 Mg2+

15、浓度至少应 比 dNTP 总浓度高 0.51.0mmol/L.适当浓度的 KCL 能使 Taq DNA 聚 合 酶的催化活性提高 5060%，其最适浓度为 50mmol/L，高于 75mmol/L 时明显抑制该酶 的活性. 1,引物和 dNTP 100ul的反应体系中通常PRIMERS的浓度为0.3uM-3uM之间.dNTPs 在 37uM-1.5uM.引物为 15-25bp.过长或过短非特异性提高. 2,模板 DNA 通常 PRIMERS 是 10 倍于 DNA 模板.如果引物对模板 DNA 的比例太 高,非特异产物会提高,PCR 效率降低.传统的 PCR 模板为 50ngDNA. 3,退火温度 退火温度和引物结合模板的能力.结合力强温度高,反之,温度低. 4,延伸温度和时间 延伸温度通常为 70-75C,时间取决于 PCR 产物的长度,一般 100bp/Sec.1KB 片段一般 1 分钟即可. 5.dNTPS 该成分为酸性,使用前应该调pH为7.0-7.5,浓度一般为20-200uM. 量高,加快反应但降低精确度. 6