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1、离子交换柱层析法分离氨基酸,指导老师：肖靓 小老师：田春丽、李洁茜,一、实验目的和要求,1.学习采用离子交换柱层析法分离氨基酸的原理和方法。 2.掌握离子交换柱层析法的基本操作技术，包括树脂的装柱加样、洗脱、检查等。,二、实验原理,离子交换树脂是具有酸性或碱性的合成聚苯乙烯-苯乙二烯不溶性高分子化合物。 各种氨基酸分子的结构不同从而导致pI点不同。各种氨基酸在同一pH时带有不同的电荷，与离子交换树脂的亲和力有差异，因此可依亲和力从小到大的顺序被洗脱液洗脱下来，达到分离的效果。,树脂对离子的亲和力，与水合离子半径、电荷及离子的极化程度有关。水合离子半径愈小、电荷愈高、极化程度愈大，则它的亲和力愈
2、大。其中静电力起主要作用。 在ph=5.8 的缓冲液中，在阳离子柱中氨基酸洗出的大体顺序为酸性、中性、碱性。本试验所用氨基酸中，Asp(天冬氨酸)是酸性氨基酸，pI=2.97;Lys(赖氨酸）是碱性氨基酸，pI=9.74。 茚三酮跟蛋白质或者多肽在加热条件下发生紫色反应,三、实验试剂,1、732阳离子交换树脂 2、2 mol/L盐酸溶液。 32 mol/L氢氧化钠溶液。 4. 标准氨基酸溶液：天冬氨酸2mg/mL、赖氨酸均配制成4mgmL的0.1mol/L盐酸溶液。 5混合氨基酸溶液：将上述天冬氨酸、赖氨酸各溶液按1:3的比例混合。 6. 两种檬酸钠-氧氧化钠-盐酸缓冲液(pH5.8，钠离子浓
3、度0.45mol/L的缓冲液和钠离子浓度为0.90mol/L的缓冲液)取柠檬酸14.25g、氢氢化钠9.3g和浓盐酸5.25mL溶于少量蒸馏水后，定容至500Ml（另一种定容至250mL），冰箱保存。 7显色剂：称取2g水合茚三酮溶于75mL乙二醇单甲醚中，加蒸馏水至100mL。 850%乙醇水溶液。,离子交换树脂转型示意图,离子交换树脂分离氨基酸原理示意图,四、实验器材,MC99-3自动液相色谱分离层析仪 层析管（20cmX1cm） 专用试管（50支） 水浴锅 铝制试管架X2 分光光度计 玻璃棒 移液管 洗瓶 硅胶管,五、实验步骤,1、树脂的准备： 将强酸型阳离子交换树脂用氢氧化钠处理成Na
4、+型后洗至中性待用。方法如下：将干的强酸型离子交换树脂用蒸馏水浸过夜或搅拌2小时，使其充分溶胀，倾去细小颗粒，再用4倍体积的2mol/L的盐酸浸泡一小时（树脂换为氢型），倾去清液，洗至中性，再用2mol/L的氢氧化钠溶液做同样处理（树脂换为钠型），洗至中性待用。,2、连接装置 梯度混合器恒流泵层析管部分收集器,3、装柱 干净的烧杯内装入大约20mL树脂和10mL蒸馏水。将层析管用层析管架固定在铁架台上适当高度，一个同学一手手执烧杯，一手用玻璃棒快速在杯口搅动树脂，使树脂缓慢均匀的流入层析管。另一个同学控制洗瓶加水的速度以及水流出的速度 注意： 1、装柱过程不可中断，倒树脂要缓慢均匀 2、刚开始
5、倒树脂时，水流出速度要控制到很小，同时可以适当多加点水。最后一段加水和放水都要慢，装柱过程中水面一定不能低于树脂，但也不能溢出。,倒好的层析管 端面平整，无气泡，约18cm高,4平衡： 将层析管与恒流泵联接，从烧杯中吸取pH=5.8钠离子强度为0.45的柠檬酸缓冲液平衡层析柱，流出液达床体积的四倍以上时，用pH试纸测流出的液体的pH，直到和缓冲液的pH一样时（即试管内的pH和缓冲液一样）即可上样。在平衡同时进行调速： 调节恒流泵流速，定时收集流出液并测量流出液的体积，根据流出液体积与所需时间计算其流速，反复调整测量直到流速约为1mL/min。,5加样: 平衡好后，停止加入缓冲溶液，待缓冲溶液弯
6、月面靠近树脂顶端时，关闭下端开口。加入0.5mL左右混合氨基酸溶液，待样品弯月面靠近树脂顶端时，立即用少量浓度为（0.45mol/L）的柠檬酸缓冲溶液冲洗层析管内壁数次，再加入缓冲液约34厘米左右。加样时应避免冲破树脂表面，且避免将样品全部加在某一局限部位。 注意：平衡、加样、洗脱时都不能冲破树脂表面,加样示意图,6.洗脱并收集: 将体积均70mL（建议适量多加）离子强度为0.45与0.9的两种缓冲溶液分别加入到梯度混合器的两个烧杯中。其中0.45的加入到直接输出溶液的那个池，如图 将层析管与恒流泵，恒流泵与梯度混合器联接。同时开始用部分收集器开始收集洗脱液，1.5ml/管50。 注意：设置首
7、管为1，若有50支管，建议末管号设置为51,7氨基酸的鉴定： 向各管收集液中加1.5mL水合茚三酮显色剂并混匀（加显色剂规则为：前10管都加，以后每隔一管加一次，但当出现显色时，周围几管都加。）在沸水浴中准确加热15min后冷却至室温，再在加过显色剂的试管中加1.5mL的50%乙醇溶液，放置10min。以收集液第二管为空白，对加过显色剂和乙醇的试管进行光波吸收测定（测定570nm波长的光吸收值）。以光吸收值为纵坐标，以洗脱体积为横坐标绘制洗脱曲线,注意： 1.试管太多，建议大家进行水浴时使用铝制试管架或100mL烧杯水浴，使用橡皮筋绑试管时一捆不要太多，否则中间的管容易脱出摔裂。水浴锅内水面刚好没过试管架中层即可。水浴完成后用镊子和抹布把试管架拿出来。 2. 应避免用手直接接触茚三酮。,六、思考题,1、为什么要使样品缓慢的进入层析柱的树脂？ 2、为什么要使用梯度缓冲液来洗脱？为什么0.45的缓冲液加入到A池中？ 3、三次加入缓冲液的作用分别是什么？ （平衡、加样、洗脱） 4、试设计利用离子交换剂分离一种含等电点分别为4.0、6.0、7.5和9.0的蛋白质混合液的方案，并简述理由。,预祝大家实验成功！,
