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1、免疫胶乳浊度分析 在自动生化分析仪上的应用,免疫比浊回顾 免疫胶乳浊度分析（immunolatex turbidimetry） 在生化分析仪上进行测定的有关问题,2,免疫比浊,3,免疫检测的基础 抗原抗体间的特异性反应 手工操作 自动化分析,核心基础,免疫比浊技术是在免疫沉淀反应（Precipitation）检测法的基础上建立的。 最早应用的免疫沉淀反应是Ouchterlony在1948年建立的琼脂双向扩散法。 1965年Mancini等和Fahey等分别建立了可以定量的单向（辐射状）免疫扩散技术。 Laurell等1966年建立了电免疫扩散法，使报告结果的时间由单向免疫扩散法的24h缩短到4
2、-5h。,4,免疫比浊,经典的免疫沉淀试验通常是在抗原与相应抗体反应的终点判定结果，存在费时、操作繁琐、敏感度低（10100mg/L）、不能自动化等缺陷。 根据沉淀反应时，抗原抗体结合后可使反应系统透光度发生改变，建立了以测定透光度为特征的微量免疫沉淀测定法法，既免疫浊度测定技术。,5,免疫比浊,1967年由Richie首次报告，20世纪70年代逐步完善，80年代初期初步应用临床常规检查。 抗原抗体在液相（特殊的缓冲液）中快速结合，形成抗原抗体复合物，反应液出现浊度。,6,免疫比浊,液相中抗原与抗体的反应结果与两者的浓度比例有关。抗原或抗体显著过量时，都只能生成少量的可溶性免疫复合物，分子极小
3、，不适于免疫比浊法检测。 免疫比浊技术要求溶液中抗体要保持中等过量，此时免疫复合物（immunecomplex，IC）仍是可溶性的。 在这种情况下，抗原与抗体的反应遵循质量作用定律（Ag+AbAg.Ab），形成IC的量是抗原或抗体的函数。 当抗体固定时，IC的量与抗原的量成正比。,7,免疫比浊,8,LIGHT SOURCE,FILTER,REACTION CUVETTE,TURBIDIMETRIC DETECTOR,NEPHELOMETRIC DETECTOR,IC,散射比浊、透射比浊 光路图,透射光+散射光,散,光,射,平光线,目前，国内开展的各项免疫检验，均求使用国家食品药品监督管理局（S
4、FDA）准入和批准的仪器和试剂。这样做不仅能使各项检查更加统一，规范，各实验室之间检查结果更具可比性，而且也可避免很多不必要的医疗纠纷。 免疫比浊技术中散射比浊法目前均用获国家食品药品监督管理局（SFDA）批准进口的自动化分析仪器和配套的各种检测项目的专用试剂。 透射比浊法（生化分析仪）可用国产试剂。,9,全国临床检验操作规程 第3版,透射还是散射,散射比浊 专用仪器 专用配套试剂 原装进口试剂昂贵,透射比浊 生化分析仪 开放试剂 （可用国产试剂）,10,速率法和终点法测定； 速率法的灵敏度和特异性优于终点法；终点法的稳定性较好；,透射还是散射,目前，由于技术的发展，两种比浊法的灵敏度和特异性
5、已接近，而全自动生化仪的自动化程度和精密度要胜于专用散射比浊仪，透射免疫比浊法在临床上的应用日益广泛。生化分析仪通过免疫比浊法技术，架起了现代生化检验和现代免疫技术的桥梁。 免疫化学是免疫学技术和生物化学技术的结合。既具有免疫学抗原抗体结合的特异性，又具有生物化学反应动力学特点。,11,透射还是散射,透射免疫比浊,可溶性抗原与其特异性抗体，在一定缓冲液中形成的复合物，经一段时间聚合后出现浊度，人射光在渗过反应液时，由于溶液内IC粒子对光线的反射和吸收，引起透射光减少，可用吸光度A表示。 用已知浓度的标准参考品建立标准曲线，测出待测抗原的含量。 透射比浊法主要用于生化分析仪。,12,透射免疫比浊
6、,免疫复合物直径为35lOOnm，这一范围要求近紫外光处入射光发出最大的干扰(最大吸收峰)，选择290410nm波长测定最佳。 由于抗原抗体结合后在短时间内(19s)形成可见的复合物，才能进行比浊。 为了提高复合物形成速度，加入促聚剂，如4聚乙二醇(MW：60008000)，可使复合物形成在310min完成。,13,比浊法中，少量的小的抗原抗体复合物极难形成浊度，除非放置较长时间；如形成较大的复合物，则抗原和抗体用量也较大，显然不符合微量化的要求。 为解决快速反应及微量化的要求，建立了免疫胶乳浊度法（immunolatex turbidimetry）。,14,免疫胶乳浊度分析 （immunol
7、atex turbidimetry）,其基本原理是： 将特异性抗体吸附在大小适中、均匀一致的胶乳颗粒上，当遇到相应抗原时，则使胶乳颗粒发生凝集。 单个胶乳颗粒在入射光波之内，不阻碍光线透过；两个或两个以上胶乳颗粒凝聚时则使透过光减少。 免疫微球凝聚的程度为被测物浓度的函数，由此可测出标本中待测物的含量。,15,免疫胶乳浊度分析 （immunolatex turbidimetry）,16,(a)带抗体的胶乳在1个波长之内可透过光线 (b)结合后，则形成光线衰减,该技术的关键在于两个方面： 首先是选择适用的胶乳，其大小（直径）要稍小于波长。用500nm波长者，选择100nm颗粒较适合；用585nm
8、波长者，则选用100200nm颗粒为好。目前多用200nm的胶乳颗粒。 其次，胶乳与抗体结合时用化学交联虽好，但失活也较严重；一般用吸附法即可。,17,免疫胶乳浊度分析 （immunolatex turbidimetry）,18,免疫胶乳浊度分析 （immunolatex turbidimetry）,胶乳颗粒多为惰性微球和羧基化微球 氨基化高分子纳米微球 氨基化纳米微球的颗粒大小较传统的微球更小（约0.1m），它与抗体的结合是通过其表面的氨基与抗体的氨基端共价结合，在微球与抗体之间有一个桥联化学臂，降低了位阻效应，不仅提高了抗体的结合率，而且还为抗体提供合适的三维空间立体结构，有效地保护了抗体
9、与抗原结合的活性区域。 与采用惰性纳米微球的传统技术相比，检测的灵敏度得到了极大的改善，最高可达到1.0ng/ml。,19,免疫胶乳浊度分析 （immunolatex turbidimetry）,（1）操作简单，可在几分钟内快速、准确地检测血清蛋白含量，真实反映病情进展和评估治疗效果，对于疾病的早期诊断和治疗具有重要的临床意义； （2）不易受人为操作和外界因素干扰，检测稳定性和重复性都很好； （3）能利用普通的生化分析仪进行检测，容易实现自动化，可在各级基层医疗机构普及和应用。,20,免疫胶乳浊度分析 （immunolatex turbidimetry）,胶乳比浊分析 颗粒增强透射免疫比浊法
10、（particle-enhanced turbidimetric immunoassay, PETIA） 胶乳增强免疫浊度测定 （Latex enhanced turbidimetric immunoassay , LETIA ） 粒子强化免疫浊度测定,21,免疫胶乳浊度分析 （immunolatex turbidimetry）,22,生化仪上开展的免疫项目,serum proteins 血清蛋白类 IgA（免疫球蛋白A） IgG（免疫球蛋白G） IgM（免疫球蛋白M） IgE（免疫球蛋白E） C3（补体C3） C4（补体C4）,Microalbumin （微量白蛋白） 2-microglob
11、ulin （ 2球蛋白） -1- acid glycoprotein （ -1酸性糖蛋白） Ferritin（铁蛋白） Transferrin（转铁蛋白）,心血管疾病监测 Apo A-1（载脂蛋白A1） Apo B（载脂蛋白B） Lp(a)（脂蛋白a） h-CRP(超敏感C反应蛋白） Homocysteine （同型半胱氨酸）,D-Dimer（D二聚体） Myoglobin（肌红蛋白） cTnI（肌钙蛋白I）,23,生化仪上开展的免疫项目,Rheuma 风湿病 RF（类风湿因子） ASO（抗链O） CRP（C-反应蛋白）,肾小球过滤率最敏感的 指标 cystatin C （胱抑素C ）,24,
12、生化仪上开展的免疫项目,25,TDM治疗药物监测 Phenobarbital （苯巴比妥） Phenytoin（苯妥英纳） Valproic acid（丙戊酸） Carbamazepine （卡马西平） Theophylline（茶碱） Gentamicin（庆大霉素） Digoxin（地高辛） Digitoxin（洋地黄）,Vitamins维生素 Vitamin B12 （维生素B12） Folate（叶酸） infectious Diseases 传染性疾病 TOXO（弓形体） RUBELLA（风疹病毒）,生化仪上开展的免疫项目,26,免疫比浊法试剂的组成,R1（试剂 I）: 缓冲液 R2
13、（试剂 II）: 启动试剂 (带或不带乳胶颗粒) STANDARDS（标准液） (一点或多点标准) CONTROLS（质控液）,27,免疫比浊法试剂的组成,R1缓冲液 R2启动试剂 校准血清,反应类型（不需要乳胶）,Ag,Ab (Reagent),28,反应类型（需要乳胶）,LATEX PARTICLE,Ag,29,30,试剂成份的功用,缓冲液: 使反应有最大限度的敏感性 避免非特异的结果 降低反应时间 启动试剂: 产生抗原-抗体反应 标准液: 建立浓度与信号（吸光度）之间的关系 质控液: 检查定标的情况,CRM470-全新的国际蛋白标准,31,32,CRM 欧共体参考局（ BCR ）的认可参
14、考品。 CRM470是14种（血清）蛋白分析物的参考制品。 CRM470基于人血清（人血清蛋白参考制备物 lot 5 ，RPPHS lot 5）的Certified Reference Material 由以下组织共同发展： IFCC BCR Brussels CAP USA,CRM470-全新的国际蛋白标准,33,CRM 470在欧洲由BCR制备提供。在美国则由美国病理协会（CAP）提供材料。 生产厂家用CRM470对自己的定标液和质控液进行标化。 CRM和SRM（Standard Reference Material标准参考材料）可以认为是目前可以提供的最高质量的材料。SRM主要用于USA
15、（国家标准和技术研究院NIST）。,CRM470-全新的国际蛋白标准,基于CRM470参考物的成人参考范围,CRM470参考物及其参考范围 血浆蛋白质 每个CRM470的参考范围（g/L） 白蛋白 3552 -1-抗胰蛋白酶 0.92.0 （-1-抗胰蛋白酶抑制剂） C3C-补体 0.91.8 C4-补体 0.10.4 铜兰蛋白 0.20.6 C-反应蛋白（CRP） 0.005 -1-酸性糖蛋白（类粘蛋白） 0.51.2 触珠蛋白 0.32.0 IgA 0.74.0 IgG 716 IgM 0.42.3 -2-巨球蛋白 1.33.0 前白蛋白（transthyretin） 0.20.4 转铁蛋
16、白 2.03.6 注：C3C在新鲜样本中可期望较低的参考范围,34,35,对实验室的生化分析仪尽可能充分的掌握并理解。 理解各个检测项目的方法学原理。 仔细认真阅读商品化试剂的说明书。 销售商或者厂家技术部门的支持。,“所谓生化分析仪就是将实验参数输入仪器，由仪器按照试验指令来完成整个试验。参数设置，基本功在仪器之外，如果对分析化学、对酶动力学、仪器性能没有一定的掌握，是很难设置好参数的。”,在自动生化分析仪上的应用,36,免疫浊度法在生化分析仪上常见的测定（分析）方式,FINAL POINT D FINAL - SAMPLE BLANK D - A FINAL - INITIAL D - B KINETIC (C - B)/ time,R2 (LATEX OR ANTISER
