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1、 热诱导乳清分离蛋白纤维：转换 水解 二硫键的形成摘要：对单独的乳清蛋白和乳清分离蛋白的纤维形成进行了研究。WPI单体变成纤维的热诱导转换在pH2和低离子环境下随着加热时间和蛋白质浓度增加而增加。以往的研究，用了沉淀法、大小排除法，质子核磁共振光谱法，报道了很宽泛的转换的值的范围。现在发现一种替代方法，就是离心过滤，给出了一致的转换图片。目前的研究结果有助于解释文献中报道的差异。在pH2时，加热纯粹的乳清蛋白或纯的牛血清白蛋白没有形成纤维，而纤维会在纯的-乳球蛋白和乳清分离蛋白溶液中形成。实验结果表明，-乳球蛋白是唯一的参与纤维形成的乳清蛋白。在所有的乳清蛋白样品中，在pH2时加热会出现水解，
2、正如用高校液相色谱和SDS-PAGE测定的那样。当WPI纤维在pH2时形成在pH7或10贮存时，会在样品中形成二硫键。2006年艾斯维尔有限公司保留所有权利。1 引言许多蛋白质在中性变性条件下会变成纤维结构。一些纤维结构是自然发生的，像细胞骨架组件的肌动蛋白和微管蛋白，而另一些是人工发生的。各类食品中的蛋白质，像乳清蛋白、大豆蛋白、蛋清蛋白，也可以形成纤维，这取决于外界条件，如pH值、离子强度、蛋白质浓度、加热条件等。这些线性的蛋白质总量，例如，可以用来作为食品中的增稠剂。乳清蛋白经常作为食品配料。商业乳清蛋白的成分，像乳清分离蛋白是从奶酪制造中获得的。最丰富的乳清蛋白是-乳球蛋白，一个分子量
3、是18400，半径为2nm的球状蛋白。蛋白质的等电点是pH值5.1。WPI是乳清蛋白的混合物，除了-LG，还有其他的球状蛋白，如-LG、BSA。在以往的研究中，我们知道纯的-LG和WPI形成纤维需要在pH2和低离子强度下长期加热。这些纤维是半灵活的，在长度上是多分散的，在横截面上是单分散性的。在WPI样品中，-LG很可能是唯一成为纤维一部分的蛋白质。我们感兴趣的是乳清蛋白形成纤维的组装动力学来优化纤维形成。有几篇论文报道了-LG在pH2和低离子强度下加热到80时的组装动力学。一个大的差异在已经报道的聚集蛋白的小部分的价值或者-LG变成纤维的转变都能在文献中找到。这些价值可以通过各种办法获得。总
4、而言之，当加热时间延长或者是增加蛋白浓聚物时，会观察到增加的转化。Aymard 等人(1999)和Veerman 等人(2002)使用沉积法来测定在pH2和温度80下加热时-LG单体变成纤维的转化。通过改变pH到接近等电点可以使聚集蛋白沉淀。留在溶液中的蛋白质假定成为非聚集蛋白。这种非聚集-LG的浓缩用278nm下的UV光谱来确定。Aymard等人(1999)确定了经过长时间加热的-LG质量分数为0.5%的聚集蛋白溶液的一小部分约45%。Veerman等人测定了大约43%的质量分数为0.5%的-LG溶液和大约70%的质量分数为4%的-LG溶液经过长时间加热的转化的程度。Schokker, Si
5、ngh, Pinder, 和 Creamer (2000) 使用体积排阻色谱和多角度激光相结合来衡量聚集-LG在pH2.5加热到80的一部分。经过4个小时的加热，我们分别从质量分数是0.5%和2%的-LG的样品中测到聚集的部分从5%变到45%。Arnaudov 等人(2003)用质子核磁共振光谱来跟踪-LG在加热到80pH2.5和低离子强度下的聚集过程。他们报道了大量的蛋白浓度低于一个很明显的聚集浓度大约2.5%的蛋白纳入到聚集蛋白的过程。很大部分-LG转化成纤维都是在浓度明显高于临界浓度。这一研究的目的是探讨乳清蛋白的热诱导聚集和乳清蛋白在pH2的混合物。对加热时间的影响、WPI的浓度、贮藏
6、时的pH的研究，运用简单新型发展的方法来测定蛋白单体变成聚集体的转变。高效液相色谱和凝胶电泳被用来确定分子质量的分布和乳清蛋白样品成分。2 原材料和方法2.1 样品准备纯的-LA，-LG和BSA从Sigma-Aldrich获得。WPI BiPRO从DSI.Inc获得。所有其他的化学品都用的是分析纯的。WPI的分离和纯化用到Weinbreck, de Vries, Schrooyen, de Kruif (2003)所描述的方法，为了移除乳清蛋白聚集体。将WPI粉末溶解到蒸馏水中，用6M的HCl将pH调整到4.75。溶液在22600转下离心30分钟，用Sorvall RC-5B高速冷冻离心机，随
7、后通过0.45nm的蛋白膜过滤(FD 30/0.45 mm Ca-S,Schleicher & Schuell, Dassel, Germany)。其他的乳清蛋白粉末溶解在pH2的HCl溶液中。随后用HCl将PH调整到2，然后再相同条件下离心过滤。蛋白质浓聚物用UV光谱在278nm下进行测定。已知蛋白浓聚物的标准线是根据蛋白质粉末的干的成分含量和用HPLC进行的乳清蛋白溶液的成分分析。2.2 转化实验（离心过滤法）一系列的测试管，包括变化的乳清蛋白浓聚物总量的样品(0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%,5%, w/w)，在pH2时加热到80。经过在0和34小时的不同的加热时间，将测试管从水
8、浴中取出然后立即放到冷水中冷却。要测定乳清蛋白单体变成聚集物的转化程度，要将加热样品用HCl溶液冲稀到质量分数0.1%，pH2。稀释的样品2ml加入到Centricon YM-100离心管中在1000转下离心过滤30分钟。在过滤液中的非聚集蛋白的浓度，用HPLC和在278nm下的UV光谱来测定。过滤物用pH2的溶液冲稀到总量2ml。通过将全部的离心过滤设备颠倒几次来混合样品，随后像以前一样离心。这一步骤是在完成第一次过滤步骤后进一步移除过滤物中的非聚集成分。通过反复冲洗聚集物，得到过滤物。各种不同部分的蛋白质总量通过称重个部分进行量化，用UV光谱进行蛋白浓聚物的确定。未加热的乳清蛋白样品作为每
9、次实验的控制量，总的蛋白回收率在95-100%。过滤分离的功效取决于已分离碎片的形状。对滤液进行电子显微观察没有看到任何纤维。实验重复三次，标出平均水平，错误指示了最大偏差。2.3 透射电镜术在离心步骤中获得的滤液和过滤物收集并用TEM验证。TEM样品用负染法制备。将一滴冲稀的样品放置在一个铜网格上的5nm厚的碳支撑膜上。15秒后将多余的用滤纸吸掉。加一小滴染色溶液，同样的在15秒后用滤纸将多余的液体吸掉。电子显微图片是用飞利浦CM 12 透射电镜获得的，工作电压80kV。2.4 HPLC乳清蛋白样品的成分通过HPLC进行分析，使用Shodex KW 803 凝胶渗透层析柱在0.6ml每分钟的
10、流速，使用的探测波长是220nm。样品用包含8M尿素的洗提液进行冲稀，然后在超过0.22微米的薄膜上进行过滤。样品中不同分离乳清蛋白数据的收集和计算，用PC1000软件。2.5 凝胶电泳PAGE通过Phast系统来实现。乳清蛋白样品会形成20%同类的凝胶在有SDS存在时，有或没有-ME确定他们的成分。加热和未加热的乳清蛋白样品在样品缓冲液中冲稀到10倍。加热的乳清蛋白样品的滤液和过滤物，经离心获得的，用缓冲液稀释到10倍。用0.1%的考马斯亮蓝R-350溶液会使凝胶褪色，参照Phast系统用户指南。3 结果与讨论3.1 转化实验转化是由聚集蛋白的比例来确定。在pH2下WPI的转化率作为加热时间
11、的函数由各种不同的蛋白浓聚物总数确定，用离心过滤的方法。图一是质量分数为4%的WPI样品的累积转化率作为加热时间的函数的展示，是既冲洗和离心步骤之后确定的。呈现的这一结果对所有的研究过的WPI浓聚物是有代表性的。反复的离心过滤后，我们发现转化程度降低，表明非聚集成分在在原始过滤物中离开了。嵌入到最初过滤物中的非聚集成分在随后的冲洗和离心过滤过程中被冲掉而且在滤液中收集了。这已经由HPLC和SDS-PAGE证实了。经过三次以上的离心过滤操作，滤液变得高度稀释而且用UV光谱测定的蛋白浓聚物不能再准确了。经过第一步离心过滤后的转化值与由Veerman等人和Schokker等人报道的对应的蛋白质浓聚物
12、的部分非聚集蛋白的值在相同范围内。图2 展示了HPCL洗提剖面图，是质量分数为4%的WPI样品在pH2时加热到804个小时的图。这一结果对于所有的研究过的WPI浓聚物有代表性。在保留时间10.5到12.1分钟之间天然的BSA从柱子上洗脱。天然的-LG在大概保留时间的13.8和15.3分钟之间被洗脱，在15.4到16.2分钟之间天然的-LA从柱子上洗脱掉。在第二次和第三次离心过滤之间获得的滤液显示了单节显示的材料的存在，表明在第一次离心过滤之后这些非聚集材料成为过滤物的一部分。这解释了由Schokker等人发现的聚集-LG的部分的值比我们这发现的值高的原因。Schokker等人在分析滤液之前只用
13、了一次过滤步骤。很可能，未聚集的材料在过滤物中，因此未聚集蛋白的部分没有测量到。在过滤物中出现的蛋白材料能聚集成更大的结构，因此在样品涂抹到HPLC柱子上前不能透过0.22微米的薄膜。任何洗提成分的缺失在过滤物中都证明经过三次离心过滤后在过滤物中都没有单节显性或者低浓度的蛋白材料的出现。这在图9和表3.3描述的SDS-PAGE结果中都有显示。在UV洗脱面的减少区域和随后的过滤步骤在图2中指出非聚集蛋白材料的移除和样品的稀释。当用TEM研究滤液和过滤物，在滤液中观察不到聚集物。在图3中，TEM显微图片显示的是质量分数为2%的WPI样品加热10小时后过滤后得到的过滤物。对于不同的加热时间我们没有观
14、察到区别。在过滤物中能观察到长的半灵活的纤维。这证明纤维能通过离心过滤从未聚集的材料中分离出来，而且不能透过薄膜。这些纤维会变得小一点经过反复的离心过滤。一种可能的解释就是在冲洗和离心过程中纤维上的剪切力会造成纤维的破碎。聚集形成，然而，仍保留很多大的不能透过薄膜的长度仍然超过1微米的结构。从图1我们清楚的看到随着加热时间的延长转化率增加，但是经过更长时间的加热水平不再变，表明聚集反应变慢经过过长时间的加热达到一个稳定的状态。当测绘到各种WPI浓聚物的转化值作为加热时间的函数，看到随着总的蛋白浓聚物的增加转化率在增加。样品加热10小时，对于1%、2%和3%的WPI测到的转化率是小于5%，对于4
15、%的WPI是20%，对于5%的WPI是45%。由离心过滤实验产生的转化比Veerman等人确定的值低。由Aymard等人和Veerman等人用到的选择沉淀法最有可能诱导聚集体的析出就像变性，但是非聚集乳清蛋白可能会引起转化结果的过高估计。这个先前也由Arnaudov等人提过。WPI样品在pH2加热到8010小时的转化率在图5中根据WPI的浓度进行了标注。总的乳清蛋白浓度达到3%时，在离心过滤方法的准确度内，这种方法的转化率是很低的。当WPI浓度超过3%时，转化率迅速增加，在图4中很清楚地可以看到。在图5中，转化率既作为WPI浓度的函数又作为WPI样品中适当-LG浓度的函数。精制的WPI包含65
16、%的-LG，因此，？，说明只有-LG聚集体能形成纤维。Arnaudov 等人(2003)报道说他们用核磁共振光谱法只能测量到质量分数高于2.5%的-LG样品，当-LG样品的浓度高于这个值时，转化会明显增加。从图5中可以看到，WPI样品转化的突然增加也发生在-LG质量分数高于2%时。以前的研究表明-LA和BSA在我们用的条件下都不能形成纤维。WPI样品中转化的突然增加与纯的-LG的转化突然增加的地方一致，证明-LA在WPI中纤维形成过程中没有什么作用。Arnaudov 等人(2003)提到的在转化率太低以致不能用核磁共振光谱确定的-LG的浓度，是一个很关键的聚集浓度。然而，聚集，确实能发生在蛋白浓度低于此-LG浓度。加热时，3%的WPI纤维聚集也能形成，就像之前通过TEM和AFM证实的那样。Arnaudov 等人(2003)通过AFM图像证实在加热过的1%的-LG溶液中包含纤维，
