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1、显微操作技术 生命科学学院 杨东 QQ1034683507,第1章 显微技术发展历史,1.1.1生物学显微技术的概念: 是基于生物学理论知识,以生物体为材料,在光学显微镜观察的范围内所开展进行的实验操作技术.,1.1.2显微镜的发明史,十六世纪的显微镜 十七世纪显微镜镜 十八世纪的显微镜 十九世纪的显微镜 二十世纪的显微镜 未来的显微镜,“昨天，今天和明天”,十六世纪的显微科学,十六世纪单式显微镜 十六世纪复式显微镜,第一个复式显微镜:詹森显微镜,十七世纪的显微科学,单式显微镜的发展,单式显微镜有一个致命的缺点, 它的焦距与透镜直径成正比,与放大倍数成反比。也就是说,焦距越短,放大倍数越大,而
2、透镜直径又越小。 如果放大倍数是100倍,透镜的焦距为0.25毫米,透镜直径大约为0.33毫米。这个比大头针头还小的透镜在当时根本制造不出来。因此,当时的放大镜的放大倍数最多不过25倍。,列文虎克和他的显微镜（约1680）,单式显微镜的顶峰-列文虎克的显微镜 AntonivanLeeuwenhoek(1632-1723)荷兰代尔夫特人，是生物学发展史上的一位重要人物，一位仅仅受过初级教育的天才科学家和显微镜制造者。 他一生亲自磨制了550个透镜，装配了247架显微镜，为人类创造了一批宝贵的财富，至今保留下来的有9架。 他最先发现了细菌，从而开创了微生物学。,复式显微镜在性能上明显优于单式显微镜
3、。一是它的放大率可以做得很高,可以把几个放大倍数较小的凸透镜组合起来获得很高的放大率。二是制造工艺较简单,不必磨制一个个极小的透镜。复式显微镜的发明,是科学史上的里程碑,人类从此开始认识微观世界。,伽利略的显微镜,胡克的显微镜,十八世纪的显微科学,十八世纪是欧洲科学复苏的时期,各种新的科学理论层出不穷。由于不被人十分重视,十八世纪的复式显微镜发展很慢,但仍然做出了一些漂亮的显微镜。,这类显微镜的特色在于: (1)新式底座。 (2)独特镜臂结构。 (3)当时最先进的聚光方法。,卡夫(Cuff)显微镜,Cuff显微镜的功能在当时是最多的.它有三种性能:透射观察,落射观察和活体观察.其中,活体观察功
4、能是在当时复式显微镜中特有的。 Cuff显微镜是当时最好的复式显微镜.,Cuff-Style显微镜,Wales显微镜,Chest显微镜,历史上最豪华的显微镜:英王GeorgeIII的银显微镜。,十九世纪的显微科学,十九世纪，随着工业革命的进行，显微科学也同其它学科一起飞速发展起来。其主要的原因是机械的使用使透镜的质量大大提高和光学的发展使显微镜的结构更加符合光学原理。,Ladd的学生显微镜,英国人WilliamLadd在1864年制造，采用了当时最先进的齿轮调焦装置 这个显微镜的镜臂上多出了一个在前几个世纪的显微镜上都看不到的东西-聚光镜 十九世纪的显微镜是今天光学显微镜的雏形,wenham显
5、微镜,由英国伦敦人FrancisWenham在1882年制造。有着当时最为精巧先进的齿轮传动系统和齿轮调焦系统,聚光系统还有成像系统 。 是十九世纪中性能最好的显微镜,也是历史上最精美的显微镜 。,Nachet偏振光显微镜,最早消除色差的显微镜之一,最早的偏振光显微镜之一,二十世纪的显微科学,由于人们在物理，数学和材料科学等领域取得了非常大的进展，显微镜的质量大大提高。 各种新型的显微镜也应运而生。 各种新技术也相继出现。 数字成像技术开始了用计算机来处理传送显微影象的时代，使人们记录显微影象的方式又前进了一步。,1.明场显微镜 2.暗场显微镜 3.相衬显微镜 4.偏光显微镜 5.干涉显微镜
6、6.紫外显微镜 7.荧光显微镜 8.体式显微镜,荧光显微镜,利用强烈的经过虑光器过滤的激发光线（紫外光或蓝紫光）激发标本（经过荧光染色或没有）产生荧光进行观察的一种显微镜。 优点：成像对比强烈，色彩鲜艳，分辨率高，可以观察到一般不可见的物质（如DNA等分子）的分布情况等。 现广泛用于免疫荧光技术和基因芯片技术。,另一种荧光显微镜,偏光显微镜,万能研究显微镜功能繁多：有明视野，暗视野，相差，偏振，微分干涉，荧光，显微摄影等等，有的还具有显微操作的功能。是一种高档次的显微镜。,万能研究显微镜,laser confocal scanning microscope, LCSM,未来显微镜的发展,一、
7、拍得更清晰 二、 放大倍数更高 三、 更为人性化的设计 四、 一体化的显微镜 五、 专门的网络化显微镜 六、 光源的革新,一、 拍得更清晰,显微镜厂商为此开发出各种各样的显微镜镜头来消除各种色差和场曲。 最近，在显微镜上普遍采用了 UIS2光学系统，它充分体现了无限远校正方式的优越性。UIS2无限远光学系统的物镜具有在宽波长范围内（由紫外至近红外区）具有一致的高透过率。同时具有更高的信噪比，不需要额外补偿就可以得到更为清晰的图像。,二、 放大倍数更高,通常情况下，目镜的放大倍数为10倍或者16倍。以40倍物镜为例，也不过是放大400倍或者是640倍，如今却能够将放大倍数提高到840倍。例如美国
8、AMG公司开发的倒置显微镜，在物镜下采用了21倍的光学放大，使得我们能够通过40倍的物镜就可以观察到放大倍数更高的图像了。如果换成100倍的油镜，就可以通过显示器观察到放大到惊人的2100倍甚至更高的图像，无不让人赞叹技术的发展之快。,三、 更为人性化的设计,四、 一体化的显微镜,也许现在我们接触到的显微镜大多是机械式的，需要手动来调焦距、调光源、调样品的位置，特别是针对细胞培养，出现了大量连续培养过程中显微观察的要求。为此，各个显微镜厂商设计了能够用于连续培养显微观察的显微镜或配件,五、 专门的网络化显微镜,Nikon公司的Coolscope和Leica公司的DMD108为临床远程病理会诊提
9、供了方便，它们专门为载玻片显微观察设计，自动转换物镜，自动对焦，得到的图像可直接通过网络发送到异地进行专家会诊。,六、 光源的革新,对于荧光显微镜，到现在为止绝大多数显微镜还在使用卤钨灯或者是高压汞灯，一方面这类光源使用寿命短，需要3到4各月更换一次，每次更换后都需要专业工程师进行位置校准；另外一方面，这类光源的强度会随着使用寿命而衰减；还有一方面，这类光源对于显微镜操作来说需要预热来等待光源强度稳定，而且光源关闭后需要等待30分钟左右才能重启.,总观光学显微科学四百多年的历史,显微科学也得到了飞速发展。我们可以看到,任何一个学科的发展都离不开其它学科的支持。,1.2显微解剖切片机发展史,“切
10、出精彩”,生物切片机已发展成为五大系列上百个品种,即 旋转式切片机 、 滑行式切片机 、 冰冻切片机、 振动切片机、 超薄切片机。,1.3染色技术发展史 1.3.1显微技术的用具及其方法演进 载玻片 盖玻片 染色缸,1.3.2 染色技术发展史,天然染料 人工染料 单染 双重染色 三重染色 四重染色,第2章 显微镜及其附加设备,一显微镜的光学性能,透镜是组成显微镜光学系统的最基本的光学元件，物镜目镜及聚光镜等部件均由单个和多个透镜组成。依其外形的不同，可分为凸透镜(正透镜)和凹透镜(负透镜)两大类。,三 影响成像的关键因素相差 由于客观条件，任何光学系统都不能生成理论上理想的象，各种象差的存在影
11、响了成像质量。下面分别简要介绍各种相差。 1 色差（Chromatic aberration） 色差是透镜成像的一个严重缺陷，发生在多色光为光源的情况下，单色光不产生色差。白光由红 橙 黄 绿 青 蓝 紫 七种组成，各种光的波长不同 ，所以在通过透镜时的折射率也不同，这样物方一个点，在象方则可能形成一个色斑。 色差一般有位置色差，放大率色差。位置色差使像在任何位置观察，都带有色斑或晕环，使像模糊不清。而放大率色差使像带有彩色边缘,色差(Chromatic aberration),P,图示：色差的产生,2.球差(Spherical aberration) 由主轴上某一物点向光学系统发出的单色圆锥
12、形光束，经该光学系列折射后，若原光束不同孔径角的各光线，不能交于主轴上的同一位置，以至在主轴上的理想像平面处，形成一弥散光斑（俗称模糊圈），则此光学系统的成像误差称为球差。 球差造成的结果是，一个点成像后，不在是个亮点，而是一个中间亮 边缘逐渐模糊的亮斑。,球差(Spherical aberration),轴上物点发出的大孔径光线不聚焦于一点,P,P,球差的矫正常利用透镜组合来消除，由于凸、凹透镜的球差是相反的，可选配不同材料的凸凹透镜胶合起来给予消除。,3.慧差： 由位于主轴外的某一轴外物点，向光学系统发出的单色圆锥形光束，经该光学系列折射后，若在理想像平面处不能结成清晰点，而是结成拖着明亮
13、尾巴的慧星形光斑，则此光学系统的成像误差称为慧差。,慧差(Coma),图示：慧差的产生,靠近光轴的物点发出的大孔径光线不聚焦于一点,X,Y,慧尾形的弥散像,图示：不同大小慧差的照片,慧差的校正：,复合透镜；,加光阑；,不晕点-同时消除了球差和慧差的一对共轭点,非球面透镜；,4 像散（Astigmatism） 像散也是影响清晰度的轴外点单色相差。当视场很大时，边缘上的物点离光轴远，光束倾斜大，经透镜后则引起像散。像散使原来的物点在成象后变成两个分离并且相互垂直的短线，在理想象平面上综合后，形成一个椭圆形的斑点。像散是通过复杂的透镜组合来消除。,造成光学系统出现轴上像散的主要原因有两个 一是光学面
14、有较大的偏心，二是光学面变形。 消除方法： 通过复杂的透镜组合来消除,5 场曲（Curvature of field） 场曲又称“象场弯曲”。当透镜存在场曲时，整个光束的交点不与理想象点重合，虽然在每个特定点都能得到清晰的象点，但整个象平面则是一个曲面。这样在镜检时不能同时看清整个相面，给观察和照相造成困难。因此研究用显微镜的物镜一般都是平场物镜，这种物镜已经矫正了场曲。,图示：场曲的产生,物平面对应的子午面、弧矢面、最小弥散圆平面为曲面,场曲,与像散结伴而生,6 畸变（Distortion） 前面所说各种相差除场曲外，都影响象的清晰度。畸变是另一种性质的相差，光束的同心性不受到破坏。因此，不
15、影响象的清晰度，但使象与原物体比，在形状上造成失真。,畸变(Distortion),畸变成像：,枕形畸变是由于视场边缘部分的放大率高于中心部分放大率所引起 桶形畸变是由于视场边缘的放大率比中心部分低所引起的,像差,球差,象散,慧差,场曲,负畸变,正畸变,光学显微镜基本结构： 1. 照明灯(Lamp) 2. 聚光器(Condenser) 3. 载物台和切片夹(Mechanical stage and specimen retainer) 4. 推进器(Mechanical stage adjustment knob) 5. 物镜(Objectives) 6. 粗细螺旋(Course and fine focus knob) 7. 目镜(Oculars) 8. 照相机等接口(Connection to camera, etc.),数值孔径N.A（ n .sin ）,数值孔径的大小代表了光镜的会聚能力。数值孔径越高，光镜的分辨力越大，所呈影像的亮度越强。,（一）数值孔径,数值孔径简写：NA，数值孔径是决定物镜性能的非常重要的参数 它是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率（n）和孔径角（u）半数的正弦之乘积。用公式表示如下： NA=nsinu/2 它与分辨率成正比，与放大率成正比，与焦深成反比，NA值增大，视场宽度与工作距离都会相应地变小。,它是一个比物镜的焦距更加实用的特性.任何设
