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1、 科研课题申请书 课题项目: 申请人: 学号: 单位: 专业申请时间: 2014 年 12 月细胞粘附分子 T-cadherin（T-cad）基因在肝癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤中因启动子甲基化而失活，其表达显著下降或缺失，推测其可能为一新的肿瘤抑制基因。申请人首次证实 T-cad 基因在脑胶质母细胞瘤 C6 细胞中的肿瘤抑制基因功能，并揭示其分子机制。本研究将在肝癌细胞株进一步研究 T-cad 基因失活与肝癌细胞的增殖及侵袭等恶性生物学特征的关系，并调查其分子机制；在临床切除的肝癌标本中研究 T-cad 基因失活与肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性生物学特征的关系，明确 T-cad 基因失活与
2、临床肝癌预后的关系；在肝癌细胞株和肝癌裸鼠模型上证实去甲基化药物是否能重新诱导 T-cad 分子表达并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭等恶性生物学特征，探索去甲基化药物对肝癌的治疗价值。该研究对进一步揭示肝癌发病的分子机制、设计合理的治疗药物及判断预后，提高我国肝癌的治疗水平具有重要意义。关 键 词：T-cadherin；肿瘤抑制基因；肝癌（一）立项依据与研究内容1、项目的立项依据原发性肝癌是高度恶性的肿瘤，尽管采取积极手术治疗，但绝大多数病人仍难免死于肿瘤复发及转移，其死亡率高居我国肿瘤死亡率的第二位。研究已表明肝癌的发生乙肝、丙肝感染及摄入黄曲霉素污染的食物有密切关系, 其发生发展与多种癌基因过度
3、表达，以及肿瘤抑制基因失活密切相关。但目前对其发生发展的精确分子机制尚不完全清楚。因此, 进一步探索研究新的基因功能改变与肝癌发生发展及其恶性特征的关系，对揭示其发生发展的精确分子机制、设计合理的治疗药物及判断预后， 进一步提高我国肝癌的治疗水平具有重要意义。T-cadherin 分子属细胞粘附分子 cadherin 超家族。 Cadherin 超家族分子为细胞表面糖蛋白，其功能主要包括调节钙介导的细胞粘附、细胞极性及形态形成，以及参与细胞间的识别和信号传导机制(1,2,3,4)。经典的 Cadherin 分子如 E-cadherin 和N-cadherin 由细胞外钙结合区及跨膜区两部分组成
4、，而 T-cadherin 因缺失经典Cadherin 分子所具有的跨膜区而经糖基磷脂酰肌醇分子附着于细胞膜上（5）,故而命名truncated-cadherin（即 T-cadherin，又称 CDH13 或 H-cadherin）。近年来对经典的Cadherin 分子的深入研究发现，E-，N-cadherin 分子缺失或突变与多种肿瘤如肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌的发生及转移特征密切相关（6，7，8,9,10）。将 E-cadherin 分子重新导入缺失 E-cadherin 分子表达的肿瘤细胞，则肿瘤细胞的增殖及侵犯能力显著受抑（11）。近年已开始有 T-cadherin 分子在肝癌、乳腺癌
5、、肺癌、结直肠癌、卵巢癌及皮肤鳞癌中表达显著下降、缺失的报导（12，13，14，15,16,17,18），推测 T-cadherin分子在这些肿瘤中可能扮演肿瘤抑制基因角色,但尚无人对其在不同肿瘤中的基因功能及其分子机制进行研究。2003 年，申请人（黄志勇）最新研究表明，将 T-cadherin 基因导入缺失表达 T-cadherin 分子的大鼠脑胶质母细胞瘤 C6 细胞使其过度表达T-cadherin 分子，C6 细胞的增殖及侵袭能力显著受抑，首次证实 T-cadherin 在大鼠脑胶质母细胞瘤中的肿瘤抑制基因功能，并进一步揭示其抑制机制是 T-cadherin 分子通过诱导 P21 CI
6、P1/WAF1 表达致使肿瘤细胞于细胞周期 G2 期阻滞。该文发表于 Molecularand Cellular Biology 2003,23:566-578（19）。这一研究发现为进一步研究 T-cadherin分子在肝癌中的功能、分子机制及临床意义奠定了坚实的基础。肿瘤抑制基因启动子甲基化导致基因失活在肿瘤的发病机制中起着重要作用（20，21，22，23）。T-cadherin 基因在乳腺癌、结直肠癌及肺癌中并未发生缺失突变，但由于其启动子异常甲基化导致 T-cadherin 基因失活，进而导致其蛋白表达水平显著下降或缺失（13,16,24）。T-cadherin 基因位于染色体 16q
7、24，肝癌的发生与染色体 16q24 的缺失、突变密切相关(25)。 Riou （2002）对位于染色体 16q24 的 13 个常常在肝癌中缺失表达的基因的转录研究发现，T-cadherin mRNA在 HepG2, PLC/PRF/C,TONG和 HA22TNGH四种肝癌细胞株中缺失表达，但 T-cadherin 基因本身并未发生缺失突变（12）。Yu（2002）进一步研究显示 T-cadherin 基因启动子在肝癌中高度甲基化，而 E-cadherin 基因启动子在肝癌中不发生甲基化，表明在 Cadherin 细胞粘附分子超家族中 T-cadherin 基因启动子甲基化在肝癌中具有高度特
8、异性,且 T-cadherin 基因启动子甲基化与 T-cadherin 基因失活密切相关（26）。这些研究表明 T-cadherin 基因启动子甲基化是 T-cadherin 基因在肝癌中失活的主要机制。Takeuchi 在对皮肤鳞癌细胞株的研究中发现，与 2ug/ml 去甲基化药物 5-aza-2-deoxycytidine 共孵 6 天能使皮肤鳞癌细胞株恢复 T-cadherin 分子表达（17）。但目前对 T-cadherin 基因失活与肝癌恶性分化程度、肝内转移及复发等恶性生物学特征的关系，以及应用去甲基化药物是否能诱导 T-cadherin 分子在肝癌细胞株中重新表达，并抑制肝癌细
9、胞的增殖、侵袭及转移等恶性特征全世界尚无研究报道。本研究将进一步研究 T-cadherin 在肝癌中的基因功能，调查缺失表达 T-cadherin 的肝癌细胞株重新表达 T-cadherin 是否能抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征，并在裸鼠肝癌模型上加以证实。同时，进一步研究其基因功能的分子机制。在临床切除的肝癌标本中研究 T-cadherin 基因失活与肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性生物学特征的关系，进一步揭示 T-cadherin 基因失活与临床肝癌预后的关系。在肝癌细胞株及裸鼠肝癌模型上证实是否去甲基化药物能重新诱导 T-cadherin 分子表达，并抑制肝癌细胞的增殖
10、、侵袭及转移等恶性生物学特征，观察其潜在的治疗作用和可能的毒副作用。由于国内外尚无类似研究报道，申请人具有研究 T-cadherin 基因与 C6 细胞恶性生物学特征的关系及其分子机制的丰富经验，预期该研究成果能达国际先进水平。主要参考文献：1. Angst BD, Marcozzi C and Magee AI. The cadherin superfamily: diversity in form andfunction. J Cell Sci., 2001, 114:629-6412. Kemler R. Classic cadherins. Semin. Cell Biol., 199
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12、insuperfamily: diversity in fromand function. J.Cell Sci 2001, 114:629-6416. Berx, G., and. Van Roy, F. The E-cadherin/catenin complex: an important gatekeeper inbreast cancer tumorigenesis and malignant progression. Breast Cancer Res. 2001,3:289-293.7. Bremnes, R. M., Veve R., Gabrielson, E. et al.
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