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1、先导化合物的发现,四川抗菌素工业研究所 药物化学 孙歆,先导化合物的发现,先导化合物 先导化合物的自然来源 先导化合物的合成来源 先导化合物的计算机辅助药物设计及举例,先导化合物,定义：是通过各种途径和手段得到的具有某种生物活性和化学结 构的化合物，用于进一步的结构改造和修饰，是现代新药研究的出发点。 来源：自然或合成的原料，计算机模拟 寻找：需要适当的检测方法，鉴定其生理学活细胞效应，或检测其与大分子靶点的结合。,先导化合物的自然来源,植物群：中草药 动物群：毒液或毒素 微生物：代谢产物 海洋生物：生物中的活性成分 人体：神经递质，激素和酶,先导化合物的合成来源,化学数据库：制药公司历年合成
2、出的新化合物贮备起来，可供用于对新靶点测试的先导化合物。 组合合成：组合合成是指用固定合成技术进行化合物的自动或半自动合成 。,计算机辅助药物设计,计算机在药物设计过程中的重要作用： 结构分析、结构比较、先导化合物设计、确定化合物的活性构象和药效团、组合化学库的设计、确定蛋白质及其键合部位的结构、研究契合物的键合情况、基于靶点设计药物、进行定量构效关系研究和三维定量构效关系研究等。,计算机辅助药物设计举例 苯并吡喃酮类化合物与Skp2蛋白的分子识别及其抑制机理研究,背景：UDDP中主要包含三种酶: 泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素蛋白连接酶E3, 其中E3与靶蛋白识别的过程是降解途径中的关
3、键限速步骤SCF（Skp1-Cullin 1-F-box）型泛素蛋白连接酶E3是其中重要的一种，包含F-box蛋白，并受到广泛关注.作为F-box蛋白家族的成员之一, S期激酶相关蛋白2（S-phase kinase-associated protein 2, Skp2）与Skp1, Cul1, Rbxl等因子组成E3连接酶, 参与催化细胞由G1期到S期的转变过程. Skp2F-box蛋白SCF型泛素连接酶E3泛素蛋白连接酶,图1 泛素蛋白连接酶E3复合体的组成和Skp2序列,苯并吡喃酮类化合物与Skp2蛋白的分子识别及其抑制机理研究,最近, Chan等通过对大量化学数据库进行高通量筛选, 发
4、现苯并噻唑类化合物BPC对Skp2 E3具有较高的抑制活性. 体外实验还发现，小分子BPC在多种动物模型中对癌细胞都有较好的抑制效果, 不过, BPC与Skp2的结合模式、识别驱动力和结合前后的构象变化等重要的科学问题尚未见报道. 此抑制剂结构如图：,图2 BPC抑制剂的化学结构,苯并吡喃酮类化合物与Skp2蛋白的分子识别及其抑制机理研究,分子对接 MD模拟 能量分解 成簇分析,材料与方法：,苯并吡喃酮类化合物与Skp2蛋白的分子识别及其抑制机理研究,分子对接： 1. 配体BPC的化学结构由ChemBioDraw Ultra 14.0绘制, 在MM2力场下能量优化后生成. 2. 蛋白质受体则是
5、基于泛素蛋白连接酶E3复合体的晶体结构（PDB代码: 1FQV） 3. 对接采用AutoDock 4.2软件包, 对接时选用W109、D110和W139三个关键残基作为盒子中心, 格点数均设为40, 格点间距为3.7510-2nm, 对接共采集128个构象, 选择最大簇中能量最低的构象作为最终对接结果.,材料与方法：,苯并吡喃酮类化合物与Skp2蛋白的分子识别及其抑制机理研究,MD模拟:对Skp1-Skp2蛋白及Skp1-Skp2-BPC对接复合物模型进行对比MD模拟, MD模拟采用AMBER 12和AMBER力场. 模拟温度为300 K, 选择NTP系综、TIP3P水模型. 1. 先进行两部
6、能量优化，第一步为约束溶质的优化，第二步为去约束优化两步都是先进行5000步最陡下降优化, 然后5000步共轭梯度优化. 2. 在进行MD模拟，同样分为两步；第一步为约束溶质的模拟，时间为0.5ns; 第二步为去约束模拟，时间为49.5ns.每模拟1 ps收集一次构象, 总共收集50000个构象, 体系模拟全过程的跟踪监测将由VMD软件完成.,材料与方法：,苯并吡喃酮类化合物与Skp2蛋白的分子识别及其抑制机理研究,能量分解:采用MM/GBSA(molecular mechanics/generalized Born surface area)方法进行能量分解, 其基本原理为：将每个残基的能量
7、贡献近似等于通过分子力学法计算得到的真空分子内能, 再采用广义波恩（generalized Born, GB）和LCPO两个模型进行计算, 得到极性溶剂化能和非极性溶剂化能, 最后把能量分解到各个原子上. 通能量分解, 可知道Skp1-Skp2中的主要氨基酸残基对BPC与之结合所做出的贡献.,材料与方法：,苯并吡喃酮类化合物与Skp2蛋白的分子识别及其抑制机理研究,成簇分析:使用MMTSB软件, 对体系Skp1-Skp2和Skp1-Skp2-BPC复合物两个MD模拟所分别得到的50000个分子构象进行成簇分析. 1.计算每个构象间的C方均根偏差. 2.建立NN的RMSD值矩阵（N表示构象数目）
8、. 3.设定RMSD的阈值, 若任意两个构象间的RMSD小于此值,则将它们归类为一簇, 再从每簇中找出能量最低的构象做为此簇的平均构象.,材料与方法：,苯并吡喃酮类化合物与Skp2蛋白的分子识别及其抑制机理研究,分子对接 MD模拟分析 分子识别 水参与的分子识别 分子的运动性,结果与讨论：,苯并吡喃酮类化合物与Skp2蛋白的分子识别及其抑制机理研究,分子对接： 图a显示，活性口袋较深, 主要由W109, D110, L117, I120, R138和W139构成. 图b显示，BPC结构中的羰基氧与D110和R138形成氢键,而D110和R138均位于Skp1和Skp2蛋白结合的界面位置. 对接
9、结果表明, BPC分子可能通过形成氢键的方式竞争性影响Skp1与Skp2的结合.,结果与讨论：,苯并吡喃酮类化合物与Skp2蛋白的分子识别及其抑制机理研究,MD模拟分析: P1C146和V150L185区域在结合小分子后的RMSF增大, 第一个区域说明BPC与Skp1-Skp2结合导致Skp1的运动幅度变大; 而第二个区域位于Skp2的F-box区域,说明小分子的结合能够影响Skp1与Skp2的结合. 图5d给出了体系Skp1-Skp2的RMSF模拟值和晶体结构中相应的实验B因子值的相关性结果. 较高的相关性（R=0.47, N=474）表明, 用于体系整体柔性分析的MD轨迹的可靠性.,结果与
10、讨论：,苯并吡喃酮类化合物与Skp2蛋白的分子识别及其抑制机理研究,分子识别: 能量分解：W109, D110, L117, I120,R138和W139残基不仅对于BPC与Skp1-Skp2识别具有较大的能量贡献, 而且空间位置距BPC很近. 其中, L117对体系结合的能量贡献最大, 通过观察三维结构, 发现L117的侧链异丁基可以与BPC中的苯并吡喃形成很强的疏水相互作用.,结果与讨论：,Skp1-Skp2中与配体BPC的结合密切相关的残基的能量分解结果(kJmol-1),苯并吡喃酮类化合物与Skp2蛋白的分子识别及其抑制机理研究,水参与的分子识别: 结合BPC前, 口袋周围水分子的数量
11、稳定在24个左右, 结合BPC减少至10个. BPC分子含多芳香环结构, 具有较强的疏水性, 推测BPC结合活性口袋后从空间位阻和疏水带电特性方面均能导致口袋周围水数目有所减少. 图c和d中可以看出,水分子未进入口袋, 仅分布在口袋两侧（Domain和，红白斑块为水分子）, 这与口袋具有较强的疏水性有关.,结果与讨论：,苯并吡喃酮类化合物与Skp2蛋白的分子识别及其抑制机理研究,分子的运动性:可以看出, 体系Skp1-Skp2-BPC的构象有4簇.体系Skp1-Skp2仅有2簇.这表明BPC的结合使得Skp1-Skp2构象运动性增加.,结果与讨论：,苯并吡喃酮类化合物与Skp2蛋白的分子识别及
12、其抑制机理研究,分子的运动性： 在尚未结合底物时, Skp1和Skp2内在的固有相向运动模式有助于底物CKI泛素化降解, 解除其对CKI的抑制作用, 促使细胞通过G1/S转折期. BPC结合后能部分地破坏Skp1与Skp2的紧密结合, 进而使Skp1有一定脱离Skp2的趋势, 对后续的CKI泛素化产生不利.,结果与讨论：,苯并吡喃酮类化合物与Skp2蛋白的分子识别及其抑制机理研究,结论： 分子对接结果表明, D110, R138可以与BPC中的二氢吡喃酮形成氢键. 氢键、能量分解及自由能计算结果表明, W109, D110, L117, I120, R138和W139是Skp2与BPC识别的关键残基; 二者识别主要靠疏水相互作用驱动. BPC的结合导致了Skp1运动模式更为剧烈, 并有脱离Skp2的趋势,这可能为该抑制剂发挥抗癌功能的主要作用之一.,谢谢,知识回顾Knowledge Review,
