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1、微生物学实验,海南大学海洋学院,实验一 细菌的形态和结构观察,一、实验目的,观察细菌的菌落特征 掌握简单染色法和细菌涂片方法 在油镜下观察细菌个体的形态特征,形态观察主要包括群体的形态和个体的形态观察。 细菌的基本形态主要分为球菌、杆菌、螺旋菌三大类，近年还发现星状和四方形细菌等。细菌形态受培养时间、培养基成分、浓度、培养温度、培养时间等发生变化。 细菌菌落大多表面光滑湿润，有光泽，一般菌落较小，质地颜色均匀，同培养基结合不紧密。菌落特征与组成菌落的细胞结构、生长状况、排列方式、好气性和运动性直接相关。 细菌个体微小，较透明，必须染色方可呈现。根据细菌个体形态观察的不同要求，可将染色分为3种类
2、型：简单染色、鉴别染色、特殊染色。,二、实验的基本原理,二、实验的基本原理,简单染色法原理：细菌在中性的环境中带负电荷，用碱性染料（解离时带正电荷）如美兰、结晶紫等进行染色。 采用加热或化学固定两种方法，使菌体粘附于玻片上，并且增加菌体对染料的亲和力,三、 实验材料,显微镜（显微镜灯）、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。 0.05% 和0.1%吕氏碱性美蓝染色液，0.5%番红染液，中性红染液，二甲苯，生理盐水 细菌三种形态的染色标本。 大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，哈氏弧菌和无乳链球菌24h液体培养基培养物 盖玻片、凹玻片、接种环、酒精灯。,简单染色法（一般染色法） .菌种：牙垢细菌 .涂片 .干
3、燥：自然气干或酒精灯高处微微加热。 固定 .染色：在整个涂面上滴加齐氏石炭酸复红，染色分钟 。 .水洗：倾去染液，用自来水细流冲洗至流下的水中无染料颜色为止。 干燥：空气中自然干燥。 镜检：在油镜下观察牙垢中的各种细菌形态并绘图。,四、实验步骤,四、实验步骤,油镜的使用 1.用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。 2.调节光亮度 3.低倍镜观察：粗调、细调 4.依次再进行中倍、高倍观察 5.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。 6.换片：另换新片，必须从第三条开始操作。 7.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸
4、擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。,显微镜保养和使用中的注意事项： 1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。 4.观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。 5.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。 6.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而
5、腐蚀镜片。,四、实验步骤,细菌三种基本形态的观察： 菌落形态观察和个体形态观察，这里主要指个体形态的观察。 1. 结合油镜的使用，观察三张细菌染色片（球状菌、杆状菌、和螺旋状菌），边观察边绘图。 2. 看示范镜：观察双球菌、四联球菌，并绘图。,四、实验步骤,思 考 题,油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？ 使用油镜时，为什么必须用镜头油？ 镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？,实验二 细菌的革兰氏染色,一、实验目的,掌握细菌的革兰氏染色 进一步熟练掌握显微镜油镜的使用技术 观察和识别细菌细胞的特殊构造,细菌细胞壁的结构和组成存在差异，因此不同细菌对
6、革兰氏染色有不同的反应（阳性和阴性）： 革兰氏阴性菌的细胞壁中含有较多脂类，肽聚糖层较薄、交联度低，当以95%酒精脱色时，脂类被溶解除去，使得细胞壁空隙变大，肽聚糖因95%酒精处理，其孔径会缩小，但由于肽聚糖含量较少，细胞壁孔径缩小有限，使得结晶紫与碘形成的紫色染料复合物被95%酒精洗脱出细胞壁之外，并被随后的红色复染剂染成红色； 革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，脂类含量少，经95%酒精脱色处理后，肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，使得结晶紫与碘形成的紫色染料复合物很难被95%酒精洗脱出细胞壁之外，因此细菌仍保留初染时的颜色，呈现紫色。,二、实验的基本原理,显微镜，酒精灯，载玻片，接种
7、环，香柏油，二甲苯，双层瓶，擦镜纸，生理盐水，吸水纸，染色缸等。 染色剂：草酸铵结晶紫染色液，卢（路）哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液。 菌种：哈氏弧菌和鳗弧菌24h普通海水琼脂斜面28培养物，金黄色葡萄球菌和芽孢杆菌24h牛肉膏琼脂斜面28培养物。,三、实验材料,革兰氏（Gram）染色法 1. 涂片 2. 初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。 3. 媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。 4. 脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约30秒，后立即用流水冲洗。 5. 复染：滴加番红染色液，染1分
8、钟，水洗后用吸水纸吸干。 6. 镜检：观察染色结果并绘图。,四、实验步骤,思 考 题,要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作？关键在哪几步？为什么？,实验三 实验室环境及人体表面的 微生物检查,认识细菌分布的广泛性； 掌握对菌落识别； 懂得无菌操作的重要性。,一、实验目的,每一菌体在适宜条件下，经过多次细胞分裂可形成一个肉眼可见的子细胞集合体，称为菌落。 由于不同细菌其个体的形态、结构、生理和生化等特征不同，当一个菌体经分裂繁殖形成菌落后，就使得菌落呈现其固有的特点。 通过合适的方法，将自然环境中的微生物接种到平板培养基上，经过培养后观察平板上的菌落，就可以检查环境中及人体细菌的数量和类型
9、。,二、实验的基本原理,无菌试管，无菌吸管，无菌空培养皿，细菌计数器，蜡笔，玻片，消毒牙签，酒精灯，接种环，无菌棉拭子等。 琼脂平板培养基，高层琼脂培养基，无菌生理盐水，2碘酒，75乙醇，普通琼脂平板，血琼脂平板，革兰氏染色剂。 水样，泥土，空气和人体。,三、实验材料,1、正常人体的细菌检查 皮肤细菌的检查 （1）将手指在平板上按一下；取一根头发，用无菌镊子贴放在平板上。 （2）平板培养、观察,四、实验步骤,咽部细菌的检查 （1）用无菌棉拭子蘸取咽部分泌的液体，然后将该棉拭子在血琼脂平板一端涂抹，接下来用接种环以涂抹处为起点，在平板上画之字形图案进行分离。 （2）将血琼脂平板置37培养箱中，培
10、养1824h，挑选不同菌落作革兰氏染色，镜检。,四、实验步骤,牙垢中细菌的检查 （1）用消毒牙签剔牙垢少许，置于玻片中央。 （2）加少许生理盐水将牙垢混匀，涂成薄层，用酒精灯干燥固定。 （3）革兰氏染色，镜捡。,四、实验步骤,2、空气中细菌的检查 （1）取4个无菌操作制备的琼脂平板，将3个分别置于实验台、走廊、窗台等位置，并打开皿盖放置1530min后，盖好皿盖；另外1个不打开皿盖作为对照。 （2）将上述4个琼脂平板置37培养箱中培养1824h。,四、实验步骤,3. 水中细菌的检查 （1）十倍梯度稀释 （2）稀释水样与培养基混合倒平板 （3）培养、观察。,四、实验步骤,对各种来源的样品进行对比
11、，如平板菌落数和菌落类型等？ 饭前为何要洗手？ 如何防止培养物的污染与防止细菌的扩散方面？,思 考 题,实 验 四 培养基的配制与灭菌,一、实验目的,1.熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备。 2.掌握培养基和无菌水的制备方法。 3.掌握高压蒸气灭菌技术。,培养基是用人工的办法将多种营养物质按微生物生长代谢的需要配制成的一种营养基质。培养基中均应含有满足微生物生长发育且比例合适的水分、碳源、氮源、无机盐、生长因素以及某些特需的微量元素外还应具有适宜的酸碱度pH值、缓冲能力、氧化还原电位和渗透压。,二、实验的基本原理,(1)药品和试剂：牛肉膏、蛋白陈、NaCl、10NaOH溶液、l0盐酸溶液、琼脂、
12、水 (2)器材：小烧杯、小铝锅、天平、牛角匙、1000mL刻度烧杯、玻棒、玻璃珠、pH试纸、试管、分装漏斗、棉花。高压蒸气灭菌锅、烘箱。,三、实验材料,一、玻璃器皿的洗涤和包装 清洗并烘干玻璃器皿：如培养皿、移液管、试管等。 棉塞的制作 包装培养皿和移液管等。,2-1棉塞制作方法,2-2移液管灭菌前的包装,四、实验步骤,二、培养基的配制,牛肉膏蛋白胨培养基的配制 （一）培养基配方： 牛肉膏2.5g 蛋白胨5.0g、NaCl2.5g、琼脂10.0g、自来水500mL、pH7.27.4。 （二）操作步骤： 1. 取一个1000mL烧杯，装500mL蒸馏水。 2. 按配方逐一正确称取各种成分，依次加
13、入水中溶解。 注意：a. 前一种成分溶解之后，才能加入下一种成分 b. 蛋白胨、肉膏可加热促进溶解 c. 加热过程应不断搅拌，以免糊底烧焦，并适当补充因蒸发而损失的水量。,3. 调pH值：用10 NaOH调pH至7.27.4，用精密pH试纸对照。 4.过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。但是供一般使用的培养基，该步可省略。 5. 分装：将培养基分装于5支试管，其余全部倒入250mL锥形瓶中，分别塞上棉塞。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上面造成污染(见图23)。分装量：固体培养基约为试管高度的15，灭菌后制成斜面（图24）。分装入锥形瓶内以不超
14、过其容积的3/5为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为宜灭菌后垂直待凝。注意不要污染棉塞和瓶口。 6. 包扎成捆，挂上标签，注明何种培养基。 7. 灭菌备用：灭菌条件：1210C（相当蒸汽压力0.103MPa）培养基灭菌后必须在37下恒温培养24h，确定无菌生长，方可使用。,图 例,图23培养基分装 图24 斜面制作,三、稀释水的制备,1.取一个250mL的锥形瓶装90(或99)mL蒸馏水，放30颗玻璃珠(用于打破活性污泥、菌块或土壤颗粒)于锥形瓶内，塞棉塞、包扎，待灭菌。 2.另取5支18mm180mm的试管，分别装9mL蒸馏水，塞棉塞、包扎，待灭菌。 无菌稀释水为微生物分离实验中所需要的材料。,四、灭菌,加热灭菌有干热灭菌和湿热灭菌。 干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器 干热灭菌的操作方法 a. 将待灭菌的物品放入恒温箱，将温度调节至160并维持2h； b. 把恒温箱的调节旋钮调回零处，待温度降到50左右，才能将物品取出。,湿热灭菌：高压蒸气灭菌法,高压蒸气灭菌法的操作步骤如下： 1. 灭菌锅内加入一定量的水。 2. 将待灭菌的物品放入锅内，并关严锅盖。 注意：器物不能装得太满。 3. 接通电源，进行加热。 4. 排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待温度计指示温度为100时关闭排气阀；或当排出的蒸气相当猛烈且
