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1、分子生物学实验技术,郭秋平,核酸和蛋白质的基本性质 及实验操作注意事项,蛋白质,一、核酸的基本性质,核酸：是以核苷酸为基本组成单位的生物信息大分子。核酸可以分为脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）两大类。,核酸（DNA和RNA）是线性多聚核苷酸， 基本结构单元是核苷酸 DNA与RNA结构相似，组成成份上略有不同,核酸的组成,核酸,核苷酸,水 解,核 酸,代表碱基,代表磷酸基,核苷酸,代表戊糖，对DNA而言为脱氧核糖，对RNA而言为核糖；,DNA的一级结构,DNA的一级结构是指DNA分子中核苷酸的排列顺序 ,DN
2、A从结构上来说是由脱氧核糖核苷单磷酸通过3，5磷酸二酯键连接而成的高聚物。从同一个磷酸基的3酯键到5酯键的方向定为链的方向。在大多数天然DNA分子长链的两端，总是有一个核糖带有自由的5磷酸，而另一端的核糖带有自由的3羟基，前者称为5端，后者称为3端。DNA链的方向就是从5端到3端。,DNA 序列,DNA分子一级结构中的显著特点，顾名思义，就是脱氧核糖了。也就是核糖的位上没有自由羟基这也就是DNA这一主要遗传物质极其稳定的根本原因。特别是对于碱的抵抗力，在pH5时，DNA链的一级结构几乎没有任何变化，而RNA链在几分钟内降解为2单磷酸核苷和3单磷酸核苷。RNA碱水解先生成一个2，3环式单核苷酸中
3、间产物，由于是一个五员环，稳定性较差，很快转变成2单核苷酸和3单核苷酸.,2,DNA一级结构的重要意义不仅在于它蕴藏了遗传信息(以密码子的方式)，而且还决定了 DNA的二级结构和空间结构 。,一、核酸杂交的基本理论 DNA的变性和复性,DNA的二级结构 Watson-Crick 右手双螺旋结构,（1）主链脱氧核糖和磷酸基通过3，5磷酸二酯键交互连接，成为螺旋链的骨架。,（4）大沟和小沟 沿螺旋铀方向观察，两条主链和碱基并不充满双螺旋的空间，双螺旋的表面形成两条凹槽，一条宽而深，叫做大沟，一条狭而浅，叫做小沟。,（2）碱基对由于双螺旋结构要求有一个正常的螺旋形式，就必须是嘌呤和嘧啶相配。 （A-
4、T，G-C）,（3）螺距 双螺旋链中的任意-条链绕轴一周所升降的距离的叫做螺距。,一、右手双螺旋结构模型的要点：,碱基位于双螺旋的内侧， 磷酸和核糖在外侧， 通过3，5磷酸二酯键构成骨架。 碱基平面与纵轴垂直， 糖环平面与纵轴平行。 大沟：宽1.2nm，深0.85nm，小沟：宽0.6nm，深0.75nm。,双螺旋的直径为2nm， 碱基堆积距离为0.34nm， 两个核苷酸之间的夹角36， 每圈螺旋含10个核苷酸，螺距3.4nm。,二、决定双螺旋结构状态的因素 1氢键： 在每一个碱基上都有适于形成氢键的供氢体如氨基和羟基以及受氢体如酮基和亚氨基。 （Tm为溶解温度） m69.3十0.41(G十C)
5、 （Marmur-Doty关系式 ）,形成氢键的特点：特异性很强 高度的方向性,2碱基堆集力 同一条链中的相邻碱基之间的非特异性作用力，即疏水作用力和Van der Waal力。 (1)加入能减弱疏水作用的试剂可以消除碱基堆集作用。 (2)DNA样品加热时，碱基堆集作用减少，同时伴随A260的增加。 (3)能够断裂氢键的试剂对于单链DNA的碱基堆集作用没有影响但是将双链DNA碱基堆集作用减少到变性DNA的程度。,3带负电荷的磷酸基的静电斥力 正离子(如Na+) 可以中和带负电荷的磷酸基团，有效地屏蔽了磷酸基之间的静电斥力，促进了双螺旋结构的稳定。,4碱基分子内能 当由于温度等因素使碱基分子内能
6、增加时碱基的定向排列遭受破坏，从而削弱碱基的氢键结合力和碱基的堆集力，会使DNA双螺旋结构受到破坏。（如加热、高温）,三：DNA的变性,概念：指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。确切地就是维持双螺旋稳定性的氢键和疏水键的断裂。 特点： 断裂可以是部分的或全部的， 是可逆的或是非可逆的。 不涉及到其一级结构的改变。,变性能导致DNA以下一些理化及生物学性质的改变。 溶液粘度降低。DNA双螺旋是紧密的“刚性“结构,变性后代之以“柔软” 而松散的无规则单股线性结构，DNA粘度因此而明显下降。 溶液旋光性发生改变。变性后整个DNA分子的对称性及分子局部的构性改变, 使DNA溶液的
7、旋光性发生变化。 增色效应或高色效应(hyperchromic effect)。指变性后DNA 溶液的紫外吸收作用增强的效应。DNA分子具有吸收250280nm波长的紫外光的特性，其吸收峰值在260nm。DNA分子中碱基间电子的相互作用是紫外吸收的结构基础,但双螺旋结构有序堆积的碱基又“束缚”了这种作用。 变性DNA 的双链解开,碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收,故而产生增色效应。,碱基含有共轭双键 最大吸收峰260nm左右,：摩尔吸光系数 A：吸收值 W：每升溶液磷重量 L ：比色杯内径,核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度表示，摩尔磷即相当于摩尔核苷酸,测量变性的方法： 光吸收法流体力学法
8、，量热法，极谱法，旋光色散法，圆二色性法，层析法等。 光吸收法：DNA中的碱基的嘌呤环和嘧啶环中的转变，在260nm有明显的吸收峰。当DNA变性时，有序的碱基排列被打乱了，于是增加了对光的吸收。 如当浓度都为50ugml时， 双螺旋DNA的 A260=1.00， 完全变性DNA即单链DNA的A2601.37 单核苷酸的等比例混合物的A2601.60。 由于DNA变性而引起的光吸收的增加称为增色效应（hyperchromicity）。 当缓慢而均匀地(目前可以做到 0.1分)增加DNA溶液的温度，记录各个不同温度下的数值，即可绘制成DNA的溶解曲线，如左图所示。当A260增加到最大增值的一半时，
9、即相当值A260达到约1185时，这时的温度叫做DNA的熔解温度或熔点，用Tm表示。这是一个鉴定DNA的非常有用和非常方便的参量。,DNA变性方法 热变性：90100 酸碱变性：常采用碱变性 化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等,指变性DNA 在适当条件下,二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象,它是变性的一种逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性,此过程称之为“ 退火”(annealing)。,四：DNA的复性,二：DNA浓度。复性的第一步是两个单链分子间的相互作用“成核”。这一过程进行的速度与DNA浓度的平方成正比。即溶液中DNA分子越多，相互碰撞结合“成核”的机会越大。,一
10、：温度和时间。一般认为比Tm低25左右的温度是复性的最佳条件, 越远离此温度,复性速度就越慢。在很低的温度(如4以下)下,则不容易发生复性。,影响DNA复性的因素,三：DNA顺序的复杂性。简单顺序的DNA分子,如多聚(A)和多聚(U)这二种单链序列复性时,互补碱基的配对较易实现。,四：离子强度,已经变性的DNA需要下列条件才能复性： (1)有足够的盐浓度以消除磷酸基的静电斥力，常用的盐浓度为0.15至0.50mo1/L的NaCI； (2)有足够高的温度以破坏无规则的链内氢键，但又不能太高否则配对碱基之间的氢键又难以形成的。一般使用比Tm低20-25的温度 。,分子杂交(简称杂交,hybridi
11、zation)是核酸研究中一项最基本的实验技术。其基本原理就是应用核酸分子的变性和复性的性质,使来源不同的DNA(或RNA)片段,按碱基互补关系形成杂交双链分子(heteroduplex)。杂交双链可以在DNA与DNA链之间,也可在RNA与DNA链之间形成。杂交的本质就是在一定条件下使互补核酸链实现复性(加热或碱处理)使双螺旋解开成为单链,因此,变性技术也是核酸杂交的一个环节。 若杂交的目的是识别靶DNA中的特异核苷酸序列,这需要牵涉到另一项核酸操作的基本技术探针(probe)的制备。探针是指带有某些标记物(如放射性同位素32P,荧光物质异硫氰酸荧光素等)的特异性核酸序列片段。若我们设法使一个
12、核酸序列带上32P,那么它与靶序列互补形成的杂交双链,就会带有放射性。以适当方法接受来自杂交链的放射信号,即可对靶序列DNA的存在及其分子大小加以鉴别。在现代分子生物学实验中,探针的制备和使用是与分子杂交相辅相成的技术手段。核酸分子杂交作为一项基本技术,已应用于核酸结构与功能研究的各个方面。在医学上,目前已用于多种遗传性疾病的基因诊断(gene diagnosis),恶性肿瘤的基因分析,传染病病原体的检测等领域中,其成果大大促进了现代医学的进步和发展。,三：杂交,杂交示意图,在核酸复性研究中,定义了一个Cot的术语,(Co为单链DNA的起始浓度,t是以秒为单位的时间),用以表示复性速度与DNA
13、 顺序复杂性的关系。在探讨DNA顺序对复性速度的影响时,将温度、溶剂离子强度、核酸片段大小等其它影响因素均予以固定,以不同程度的核酸分子重缔合部分(在时间t时的复性率)取对数后对Cot作图,可以得到如图所示的曲线,用非重复碱基对数表示核酸分子的复杂性。在DNA总浓度(以核苷酸为单位)相同的情况下，片断越短，片断浓度就越高，复性所需的时间也越短t1/2也越小 。,四：Cot 曲线,蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。 蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。,Protein,1 蛋白质的结构组成,蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外
14、，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、碘、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为： 碳 50 氢 7 氧 23 氮 16% 硫 03 其他 微 量,氨基酸（amino acid）是组成蛋白质的基本单位。组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种。,氨基酸的理化性质 1.两性解离及等电点：所有氨基酸都含有碱性的-氨基和酸性的-羧基，因此氨基酸是一种两性电解质，具有两性解离的特性。 2.紫外吸收性质 根据氨基酸的吸收光谱，含有共轭双键的色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm波长附近。 3.茚三酮反应：可作为氨基酸定量分析方法。,氨基酸的 光吸收,构成蛋白质的20种氨基酸在
15、可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)均有光吸收。 在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。 酪氨酸的max275nm，275=1.4x103; 苯丙氨酸的max257nm，257=2.0x102; 色氨酸的max280nm，280=5.6x103;,氨基酸的离解性质,氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。 在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化。,PH 1 7 10 净电荷 +1 0 -1 正离子 两性离子 负离子 等电点PI,氨基酸的等电点,当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为0。这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。 侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK1和pK2的算术平均值：pI = (pK1 + pK2 )/2 同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK值的算术平均值。 酸性氨基酸：pI = (pK1 + pKR-COO- )/2 碱性氨基酸：pI = (pK2 + pKR-NH2
