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1、四、层析,（一）、层析的由来与发展,1901年，俄国植物学家茨维特将植物色素提取液加到装有碳酸钙微粒的玻璃柱子上部，继而以石油醚淋洗柱子，结果使不同的色素在柱中得到分离而形成不同颜色的谱带。混合色素通过碳酸钙微粒被分离成不同色带的现象，像一束光线通过棱镜时被分离成不同色带的光谱现象一样。 1906年在一篇论文中将这种方法正式命名为色谱法，色谱法由此得名。,1931Kuhn, Lederer用氧化铝和碳酸钙分离-、-和-胡萝卜素。使色谱法开始为人们所重视。1938Izmailov, Shraiber最先使用薄层色谱法。1938Taylor, Uray用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。1941
2、Martin, Synge提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。1944Consden等发明了纸色谱。,1949Macllean在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段。1952Martin, James从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。1956Van Deemter等提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。1957基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。1958Golay发明毛细管柱气相色谱。,1、原理,色谱法(Chromatography），也称色层法或层析法(后文中我们称之为层析法）。此种方法基于混合液中各组分的分子极性、分子大小
3、与形状、吸附力、亲和力等物理化学性质的差异，导致各组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，组分在两相间进行连续多次分配，从而彼此分离。 层析不只是分离技术，也是一种分析方法。,层析分离法基本原理,9,在色谱操作中，加入洗脱剂而使各组分分层的操作称为展开（Development），洗脱时从柱中流出的溶液称为洗脱液（Eluate），而展开后各组分的分布情况称为色谱（Chromatography）。,2、层析方法的共同特点：,层析分离体系都有流动相和固定相两个相。 层析过程中，流动相对固定相作连续的相对运动。被分离样品在两相中具有不同的作用力，各组分混合物在流动相的带动下通过固定相，实现分离。,层析
4、分离方法,1. 固定相：层析基质2. 流动相：洗脱剂(柱层析）、 展层剂（薄层层析）3.操作容量：在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量。一般以每克基质结合某种成分的mmol数或mg数表示。,（二）常用术语,4. 床体积：膨胀后基质在层析柱中所占有的体 积（Vt）。5. 洗脱体积：某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现，浓度达到最大值时流动相的体积。6. 膨胀度：单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积（V）。7. 分配系数和迁移率,外水体积 Vo,洗脱体积 Ve,固定相,层析床,（三）、吸附柱层析,吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的层析方法。,在洗脱过
5、程中，柱内不断地发生解吸、吸附，再解吸、再吸附的过程。经过一段时间以后，该物质会向下移动一定距离。此距离的长短与吸附剂对该物质的吸附力以及溶剂对该物质的解吸(溶解)能力有关。,1、洗脱原理,吸附柱层析成败的关键是选择合适的吸附剂、洗脱剂和操作方式。,2、 吸附剂的选择,吸附剂：将其它物质聚集到自己表面的物质。 被吸附物：能聚集于吸附剂表面的物质。 在选择具体吸附剂时，主要是根据吸附剂本身和被吸附物质的理化性质进行的。一般来说， 极性吸附剂易吸附极性物质，非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。但是为了便于解吸附，对于极性大的分离物，应选择极性小的吸附剂，反之亦然。,（1）羟基磷灰石 羟基磷灰石Ca5
6、(PO4)3OH2，简称HA的吸附容量高，稳定性好(在T85，pH5.5-10.0均可使用)，因此在制备及纯化蛋白质、酶、核酸、病毒和其它生命物质方面得到了广泛的应用。有时有些样品如RNA、双链DNA、单链DNA和杂合型双链DNA-RNA等，经过一次HA柱层析，就能达到有效的分离。 HA的Ca2+基团和生物分子表面的负电荷基团的相互作用，在用HA分离生物分子过程中起着重要作用。而HA的PO43-基团与生物分子表面的正电荷基团的相互作用，则仅起着次要的作用。,使用HA作为固定相基质的注意事项： (1) HA系干粉时，要先在蒸馏水中浸泡，使其膨胀度(水化后所占有的体积)达到2-3mL/克后，再按1
7、6体积加入缓冲液悬浮，以除去细小颗粒； (2) HA悬浮液须用旋涡振荡器混合，若用磁棒或玻棒搅拌时，HA的晶体结构会被破坏； (3) 忌用柠檬酸缓冲液和pH5.5的缓冲液。 (4) 就操作容量来说，一般细颗粒HA比粗的大。而从分辨率比较，粗颗粒HA也没有细的好。,（2）硅胶 是最常用的吸附剂，通常用SiO2.xH2O表示，是具有硅氧交联结构，表面有许多硅醇基的多孔性微粒。硅醇基可与极性化合物或不饱和化合物形成氢键而使硅胶具较强的吸附力。 水能与硅胶表面羟基结合而使其失去活性，经加热可被除去的水称自由水，若自由水含量达17%以上，则吸附力极低，此时，硅胶只能用于分配层析。若将硅胶在105-110
8、加热30min ，吸附能力显著增强，这一过程称为活化。如果将硅胶加热到500，硅醇基结构会变成硅氧烷结构，吸附能力显著下降。 硅胶具有微酸性，适用于分离酸性和中性物质，如有机酸、氨基酸、甾体等。,柱层析硅胶,变色硅胶（也称蓝胶）是以具有高活性吸附材料细孔硅胶为基础原料经过深加工制成的,细孔硅胶为无色或微黄色透明状玻璃体，它的基本质量参数如下：平均孔距2.0-3.0MM,（3）氧化铝 分酸性、碱性和中性三种，酸性氧化铝(pH4-5)适合于分离酸性化合物，碱性氧化铝(pH9-10)适合于分离碱性化合物，中性氧化铝(pH7)适合于分生物碱、挥发油、萜类、甾体及在酸、碱中不稳定的甙类、酯类等化合物。
9、氧化铝用前也需脱水活化，通常于400高温下加热6h，使氧化铝的含水量在0%-3%之间， 可得到级或级氧化铝，但温度过高也会破坏氧化铝的内部结构。4.大孔吸附树脂和聚酰胺近年用于中药活性成分的分离。,活性氧化铝,氧化铝空心球,氧化铝粉,高温氧化铝,氧化鋁絲,3、洗脱剂的选择,洗脱剂指的是能够驱使固定相中的有效成分和部分杂质沿一定方向有规律移动，并能够使有效成分与其他组成物分开的缓冲液。通常它们也是溶解被吸附样品和平衡固定相的缓冲液。合适的洗脱剂应符合下列条件：,纯度较高； 稳定性好； 能较完全洗脱所分离的成分； 黏度小； 易和所需要的成分分开。,4、 操作,柱层析的设备主要有层析柱、部分收集器、
10、磁力搅拌器和恒流泵。有条件时，配置一台检测仪和一台记录仪就构成一个完整的层析系统。,（1）层析柱 层析柱是下端有细口并带有筛板的玻管。柱的直径与长度之比，一般为110- 140。采用极细吸附剂装柱时，宜用比例大的层析柱。反之，则宜用比例小的层析柱。这样有利于节省时间和提高分辨率。层析柱的床体积是由吸附剂的量和膨胀度决定的。,（2）吸附剂的用量 吸附剂的用量是根据其自身的操作容量和分离物中各成分的性质决定的。当操作容量高时， 吸附剂用量少。一般吸附剂的用量为被分离样品的30-50倍。若样品中各成分的性质相似难以分开时，则吸附剂用量应增大，有时大于样品的100倍,（3）装柱 装柱的方法分干装法和湿
11、装法两种。湿装法系先加适量平衡液到柱内，排走其中的空气，然后把预先用平衡液浸泡好的吸附剂搅匀，随即将此悬浮液连续倾入柱中，待其自然沉降至柱高的1/4-1/3时打开柱下端口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液徐徐下降至需要的高度。 这种装柱法对各种基质都适用。层析柱中基质应合乎填装均匀、松紧一致和没有气泡的标准。,（4）上样和洗脱 上样：用滴管轻轻地把样品溶液加到固定相表面，要尽量避免冲动基质。加入样品液的体积一般应小于床体积的1/2。洗脱：待样品液的液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱剂，并在柱上端与装有洗脱剂的贮液瓶连接开始冼脱。同时在柱下端与部分收集器接通，立即进行分级收集(按体积或时间分管收
12、集)。,理想的洗脱曲线如图3-1所示。图中的A峰和B峰均呈对称形，二者没有重叠，这表明样品液中的组分已完全分开。层析峰的面积(FEG)、峰高(BE)和半峰高宽度(HI)等参数是定性、定量洗脱物的依据。,为了获得满意的分离结果，洗脱液的流速务必恰当控制。如果太快，洗脱物在两相中的平衡过程不完全；如果太慢，洗脱物会扩散。若峰与峰之间有重叠，宜降低洗脱剂的离子强度，若峰间距离过大，或某些成分不能洗脱时，宜加大洗脱剂的强度(极性)，成分复杂时，可采用洗脱剂由弱到强的梯度洗脱(方法见离子交换层析)。 由层析柱分离出的样品经浓缩或冻干处理后，可进行纯度测定。如杂质含量仍大时，应该用其它方法继续纯化。,（5）、注意事项,流速太慢，前峰拖尾与后峰相连,流速太快，组分分不开,正常的流速使组分完全分离,
