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1、怎样用好高效液相色谱,福立分析仪器有限公司,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,常见的液相色谱仪问题 色谱峰加宽 分辨率低 裂峰 柱压比预期值高,液 相 色 谱 仪 的 使 用,正确连接液相色谱仪系统可使用户受益，原因如下： 相对比较便宜 不需要花费大量的时间 系统中大多数流体连接均易于检修 通常有助于避免不必要的硬件替换 接头对正确连接至关重要，因此知道接头的 一些基本特点也很重要。,液相色谱仪的正确连接,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,接头的普通特征 螺纹（10-32， -28， M6x1） 管道外径（1/16”、1/32”、1/8”） 端口几何形状
2、（锥形、平底） 管套直径,接头要素,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,套圈固定管道，并且始终以相同方式固定用力按入圆锥形端口，如下图所示,套圈锥度 （或角度）,端口锥度 （或角度）,接头要素,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,然后在套圈接触内套处压紧管壁。,接头要素,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,通用端口有以下特征： 螺纹 管道尺寸 内部几何形状 但并非所有的接头都是通用的!,接头要素,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,接头要素,管套的深度并非通用!,即使是最好的接头，如果不正确使用也会 产生许多问题。为什么会
3、出现问题？,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,接头要素,以下示例解释了不匹配的接头导致多种色谱法问题的原因：,如果前端太长，套圈不能密封因而会发生泄漏,如果前端太短，套圈可以密封但是将会导致无效空间和混合的发生,液 相 色 谱 仪 的 使 用,接头要素,液相色谱仪的正确连接,连接出现泄漏后将会引发以下问题： 系统压力损失 注射假象（鬼峰） 出现混合室（死体积）将会引发以下问题： 色谱峰加宽 分辨率减低 显著残留 裂峰 引发色谱法问题的原因很多时，接头不匹配或使用不当将可能导致液相色谱仪的所有主要问题发生!,液 相 色 谱 仪 的 使 用,接头要素,液相色谱仪的正确连接,选择
4、匹配的接头时，应首先清楚以下问题： 使用的端口螺纹类型（例如， 10-32、 -28 等。） 使用的端口几何尺寸 （例如，锥形或平底） 所需连接的管道外径（例如， 1/16”， 1/8”） 是否可以手动紧固连接 接头应与哪些化学药品兼容 接头应该承受多大压力,液 相 色 谱 仪 的 使 用,管道要素,液相色谱仪的正确连接,关于液相色谱仪中的管道，以下三个要素必须考虑： 管道的正确型号 管道的最有效尺寸 切割管道的合适工具 如果想获取最好的色谱法效果，必须考虑这三个方面！,液 相 色 谱 仪 的 使 用,管道要素,液相色谱仪的正确连接,如果您想选择适合应用需要的管道类型，请考虑以下问题： 管道在
5、系统中的使用位置 哪种管道材料能够实现最好的兼容性 产生多少压力 可提供多种不同类型的管道 高压管道：不锈钢、PEEK、Radel R、 PEEKsil等。 低压管道: Teflon FEP、 Teflon PFA、Tefzel等。,液 相 色 谱 仪 的 使 用,管道要素,液相色谱仪的正确连接,选择合适的管道尺寸时，请考虑以下问题： 接受端口需要什么尺寸的管道？ 流速多少？ 管道将会产生多大压力？ 接头提供的管道尺寸是多少？ 请始终注意 -高压管道最常见的尺寸为：1/16” OD x .010” ID -低压管道最常见的尺寸为： 1/8” OD x 1/16” ID,液 相 色 谱 仪 的
6、使 用,管道要素,液相色谱仪的正确连接,这是系统低压、 高流量区域。,这是系统高压、 低流量区域。,这是系统低压、 低流量区域。,液 相 色 谱 仪 的 使 用,管道要素,液相色谱仪的正确连接,在具体应用中，仅仅选择合适的管道类型和正确的管道尺寸还远远不够，但是 如果管道切割不当， 那么结果可能仍不理想。,液 相 色 谱 仪 的 使 用,管道要素,液相色谱仪的正确连接,正确的切割技术确实能影响色谱法的质量 不正确切割 正确切割,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,储液器和泵之间的管道连接 管道通常用Teflon材料制造，尺寸为1/8” OD x 1/16” ID。 将管道连接
7、至泵上的接头通常为-28螺纹，平底几何形状。 泵和检测器之间的管道连接 管道通常用PEEK聚合体或不锈钢材料制造，尺寸为： 1/16” OD x .010” ID 或稍小。 将管道连接至系统部件上的接头通常为10-32 螺纹，锥形 几何形状。 检测器之后的管道连接 管道通常用Teflon材料制造，尺寸为1/16” OD,选择正确接头和管道的一般准则,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,管道内径的公英制换算,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,HPLC系统不同部位的管道,液 相 色 谱 仪 的 使 用,液相色谱仪的正确连接,不同色谱柱的管道使用指南,液 相 色
8、 谱 分 析,分析型液相色谱 定性及定量分析 a.灵敏度的要求 b.样品的复杂性 c.样品量的要求 d.精度及准确度的要求 e.容易使用,液 相 色 谱 分 析,制备型液相色谱 分离及纯化 a.化合物的稳定性 b.样品的复杂性 c.制备量的要求 d.纯度的要求及纯度的鉴定 e.方法的安全性,液 相 色 谱 分 析,Q：需要什么样的分离结果？ A：分辨率高。,液 相 色 谱 分 析,什么是色谱的分辨率？,分辨率R的公式：,液 相 色 谱 分 析,影响分辨率的因素：K，a，N,分辨率的方程：,K是容量因子，表达了样品与填料的作用强弱。 a是选择性系数，描述两化合物分离的好坏程度， 是化学因素。 N
9、是理论塔板数，描述色谱峰的谱带展宽程度。,液 相 色 谱 分 析,色谱柱的柱效N,理论塔板数计算公式：,液 相 色 谱 分 析,提高柱效的方法,色谱柱本身 减小填料的颗粒度 找到最佳的流速（根据不同的内径） 合适的温度 降低溶剂的粘度 增加柱长,液 相 色 谱 分 析,其他影响柱效的因素,柱外效应 连接管路 进样器 检测器 进样体积 样品浓度,液 相 色 谱 分 析,容量因子K,与峰高的关系 与R的关系,改变K值的方法： 调节流动相的极性、pH、离子强度等 梯度淋洗,k=(tR-t0)/ t0,液 相 色 谱 分 析,选择性系数a,定义：,a1时两组分分不开，,改变a的途径： 改变流动相 改变
10、固定相 改变温度 改变样品的本身性质,液 相 色 谱 分 析,a、K、N 如何控制分辨率,原始分离状态,改变 K 后,改变 a 后,改变 N 后,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,等度分析 色谱柱：C18，4mm30mm 流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱 流速：2ml/min 样品： 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben),液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,改变容量因子 K,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,改变
11、选择性a,通过改变流动相改变选择性 同样强度的不同溶剂 改变色谱柱,1,2,3,THF/H2O 28:72 MeOH/H2O 58:42 CH3CN/H2O 38:62,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,梯度方法的建立,梯度洗脱的特点 优点 单位时间的分离能力增加 检测灵敏度提高 缺点 仪器设备要求高 不适合某些检测方式 柱需再生 定量分析的重复性较低 分析时间长,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,梯度的洗脱方式,高压梯度及低压梯度,溶剂 A,溶剂 B,泵 A,泵 B,混合器,A 高压梯度,溶剂 A,泵,溶剂 B,比例阀（溶剂混合点）,混合器,B 低压梯度,（溶剂混合点）,
12、液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,梯度洗脱的可变参数,A及B(可能还有C和D液)的 成分和化学特性 梯度的陡度 梯度的变化形状,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,如不用梯度：分离不理想,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,梯度条件的优化,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,梯度曲线的变化凹线,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,梯度曲线的变化凸线,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,梯度平衡时间的影响（一）,10分钟的梯度，6分钟的平衡时间色谱图不重复,液 相 色 谱 分 析,分析方法建立的实例,梯度平衡时间的影响（二）,平衡时间6分钟,平衡时间7分钟,平衡时间8分钟,平衡时间9分钟,平衡时间从6到7分钟，第一个峰的保留时间有明显的变化，说明6到7分钟的平衡时间不足，而8到9分钟变化不大因而大于这个时间时，平衡充足。,
