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1、2017/5/29,第12章高效液相色谱分析法,一、高效液相色谱仪HPLC二、高效液相色谱法的特点Feature of HPLC三、流程及主要部件General process and main assembly of HPLC,第一节高效液相色谱的特点与仪器,High performance liquid chromatograph,Feature and instrument of HPLC,2017/5/29,一、液相色谱仪器 High performance liquid chromatograph,2017/5/29,液相色谱仪（2）,2017/5/29,液相色谱仪（3）,2017/
2、5/29,液相色谱仪（4）,2017/5/29,Nexera 组件,检测器,岛津高灵敏度检测器阵容，UV、PDA、RF、MS 规格 高速采样,2017/5/29,二、高效液相色谱法的特点 Feature of HPLC,特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。,2017/5/29,三、流程及主要部件Process and main assembly of HPLC,1.流程,2017/5/29,2.主要部件,（1）高压输液泵主要部件之一，压力：150350105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因
3、此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性。,2017/5/29,（2）梯度淋洗装置,外梯度: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。,内梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。,2017/5/29,（3）进样装置,流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：,2017/5/29,（4）高效分离柱,柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。,2017/5/29,（5
4、）液相色谱检测器,a. 紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点： 灵敏度高； 线形范围高； 流通池可做的很小（1mm 10mm ，容积 8L）； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。,2017/5/29,b. 光电二极管阵列检测器,紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。,2017/5/29,2017/5/29,光电二极管阵列检测器,2017/5/29,c. 示差折光检测器（differential refractive index detector）,除紫外
5、检测器之外应用最多的检测器。 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比。,通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）。 灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱。 偏转式、反射式和干涉型三种。,2017/5/29,示差折光检测器,2017/5/29,d. 荧光检测器（fluorescence detector）,高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。,2017/5/29,一、液-固吸附色谱liquid-solid adsorption chromatograph二、液-液分配色谱liquid- li
6、quid partition chromatograph三、离子交换色谱ion-exchange chromatograph四、离子色谱ion chromatograph五、离子对色谱ion-pair chromatograph六、排阻色谱size- exclusion chromatograph七、亲和色谱(AC)Affinity chromatograph,第二节主要分离类型与原理,Basic principle and main separating types,2017/5/29,一、液-固吸附色谱Liquid-solid adsorption chromatography,固定相：固
7、体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂。 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸。 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性。 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。,2017/5/29,二、液-液分配色谱Liquid- liquid partition chromatography,固定相与流动相均为液体（互不相溶）。 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配。 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性
8、大于固定液的极性（反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反。 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用。 化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。,2017/5/29,三、离子交换色谱Ion-exchange chromatography,固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂。 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液。 基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保
9、留时间长。 阳离子交换：RSO3H +M+ = RSO3 M + H + 阴离子交换：RNR4OH +X- = RNR4 X + OH- 应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。,2017/5/29,四、离子色谱Ion chromatography,离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一中技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。 有关内容将在第十章第六节中讲授。,2017/5/29,五、离子对色谱Ion pair chromatography,原理：将一种（或多种）与溶质离子
10、电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配； 阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子； 阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子； 反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+ X -后；在两相间分配。,2017/5/29,六、排阻色谱色谱Size- exclusion chromatography,固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)。,原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝
11、胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。 全部在死体积前出峰。 可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离。,2017/5/29,七、亲和色谱(AC) Affinity chromatograph,原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。,先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。,2017/5/29,一、液相色谱固定相sta
12、tionary phase of HPLC二、液相色谱流动相 mobile phase of HPLC,第三节液相色谱的固定相与流动相,Stationary phase and mobile phase of HPLC,2017/5/29,一、液相色谱固定相Stationary phases of LC,1. 液-液分配及离子对分离固定相（1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见。 现采用10m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料。,（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 3040m的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 2
13、m的多孔硅胶。 表面积小，柱容量底。,2017/5/29,（3）化学键合固定相,化学键合固定相：目前应用最广、性能最佳的固定相。 a. 硅氧碳键型： SiOC b. 硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： SiC d. 硅氮键型： SiN,2017/5/29,化学键合固定相的特点：,（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击； 耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定； （4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；（5）有利于梯度洗脱。,存在着双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖
14、率：分配为主；低覆盖率：吸附为主。,2017/5/29,2.液-固吸附分离固定相,种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等； 结构类型：全多孔型和薄壳型； 粒度：510 m。,2017/5/29,3.离子交换色谱分离固定相,结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂 薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂；（2）离子交换键合固定相 薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团） 树脂类别：（1） 阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）（2） 阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）,2017/5/29,4. 空间排阻分离固定相,（1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构； 水为流动相。适用于常压排阻分离。（2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶； 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等； 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。,2017/5/29,二、液相色谱的流动相 Mobile phases of LC,
