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1、一、名词解释：1、梯度洗脱：在同一个分析周期中，按一定程度不断改变流动相的浓度配比，称为梯度洗脱。从而可以使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。或者答流动相由几种不同极性的溶剂组成，通过改变流动相中各溶剂组成的比例改变流动相的极性，使每个流出的组分都有合适的容量因子k，并使样品种的所有组分可在最短时间内实现最佳分离。（可在离子交换层析中查)。2、分辨率：是相邻两个峰的分开程度，用相邻两峰对应的洗脱体积之差比上两个半峰宽之和的平均值表示。3、亲和层析：利用生物分子与其配体间特异性的、可逆性的亲和结合作用而对样品进行分离，配体被固定在载体上，特异性结合经过
2、的与其亲和性的生物分子的一种层析技术。4、等电聚焦：使电泳的介质中形成一个连续的、稳定并有一定范围的线性pH梯度，电泳时蛋白质等待分离的两性分子可以在这种pH梯度中迁移，直到迁移聚集于与其等电点（pI）相同的区域，从而形成一种分辨率极高的电泳聚焦效应。5、盐析：增加中性盐浓度使蛋白质、气体、未带电分子溶解度降低，以致使电解质类物质从溶液里沉淀出来的一种作用现象。附资料：它是蛋白质分离纯化中经常使用的方法，最常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等。6、保留时间tR：从开始进样至柱出口处被测组分出现浓度最大值时所需的时间,称为保留时间。层析分离技术的一个参数。7、双向电泳：等电聚焦电泳和SD-PA
3、GE的组合的电泳方法，即先进行第一向水平电泳等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行第二向垂直电泳SD-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。8、密度梯度离心：在呈密度梯度的惰性介质中以一定的离心力进行离心，让各组分会依其密度分布在梯度中与其自身密度相同的液层中的依密度而分离的离心法。附资料：密度梯度可以离心前预先制备(如叠加不同浓度蔗糖、甘油)或在离心中自然形成(如使用氯化铯时)。可用于分析型或制备型的离心分离。通常分为差速区带离心和等密度离心两种方式。二、填空题（要点)：2、最常用的几种蛋白质的沉淀方法:盐析法(中性盐沉淀)、有机溶剂沉淀、选择性沉淀(热变性沉
4、淀和酸碱变性沉淀)、等电点沉淀、有机聚合物沉淀、聚电解质沉淀法、金属离子沉淀法。4、细胞破碎的方法：1)物理：高压匀浆法、珠磨法、超声波破碎法、渗透压冲击法；2)化学：外加酶法、酶自溶法、化学试剂法。5、聚丙烯酰胺凝胶单体：（一些资料）聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylam idegelelctrophoresi）聚丙烯酰氨凝胶电泳，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMD）为加速
5、剂。在聚合过程中，TEMD催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。6、DEA-纤维素吸附酶和蛋白质时常用pH为79，然后提高盐浓度（使蛋白质与交换剂的结合键减弱）或降低pH使之洗脱7、毛细管电泳：HPCE中电渗流的作用电场作用下，毛细管柱中出现电泳现象和电渗流现象，电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的57倍。各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：+=电渗流+ef阳离子运动方向与电渗流一致，在电渗加速度的作用下，在负极最先流出。0=电渗流中性粒子无电泳现象，运动方向与电渗流一致；受电渗流影响，在阳离子后流出-=电渗流
6、-ef阴离子运动方向与电渗流相反，受电渗反作用力影响，阴离子在负极最后流出。随着迁移速度不同，逐渐形成样品谱带。8、转速与离心力倍数的转换公式：RCF=离心力F重力=m 2r/m g=2r/g=（2*r/*rpm）2*r=（0.1471*rpm )2*r9、亲和层析是利用配体与其目标蛋白间进行特殊的、可逆性的亲和结合作用而实现分离纯化，通常用凝集素对糖蛋白进行色谱分离，用抗原或金黄色葡萄球菌蛋白A（ProteinA）？配体对制备的抗体（lgG）进行色谱分离。10、？1、白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析和凝胶过滤的办法除盐12、离子交换层析装柱时，树脂在柱内有明显
7、的分界线，这是由于什么原因造成的？答：附资料：装柱转型再生好的交换剂先放人烧杯，加入少量水，边搅拌边倒人垂直固定的层析柱中，使交换剂缓慢沉降。交换剂在柱内必须分布均匀，不应有明显的分界线，严防气泡产生，否则将严重影响交换性能。为防止气泡和分界线(即所谓“节”)的出现，在装柱时，可在柱内先加入一定高度的水，一般为柱长的13，再加人交换剂就可借水的浮力而缓慢沉降。同时控制排液口放速率，以保持交换剂面上水的高度不变，交换剂就会连续地缓慢沉降，“节”和气泡就不会产生。13、亲和层析中常用的糖基化活化的方法有溴化氰法和环氧法。糖蛋白常用的配体是凝集素，用于抗体纯化的配体通常是抗原或者金黄色葡萄球菌蛋白A
8、(SPA)。附资料：介绍一些常用的活性基团及活化方法。(1).溴化氰活化溴化氰活化法是常用的活化方法之一，活化过程主要是生成亚胺碳酸活性基团，它可以和伯氨基（NH2）反应，主要生成异脲衍生物。溴化氰活化的基质可以在温和的条件下与配体结合，结合的配体量大(2).环氧乙烷基活化这类方法活化后的基质都含有环氧乙烷基。另外也可以用环氧氯丙烷活化，将环氧乙烷基结合在基质上。上面两种方法是比较常用的方法，另外还有很多种活化方法如：N羟基琥珀酰亚胺活化、三嗪活化、高碘酸盐活化、羰酰二咪唑活化等14、常用的电泳染色法有考马斯亮蓝染色法和银染色法，其中银染色法灵敏度高，考马斯亮蓝染色法线性宽。附资料：检测蛋白质
9、最常用的染色剂是考马斯亮蓝R250（CB，Com asiebriliantblue），通常是用甲醇：水：冰醋酸（体积比为45：45：10）配制0.1或0.25（W/V）的考马斯亮蓝溶液作为染色液。这种酸甲醇溶液使蛋白质变性，固定在凝胶中，防止蛋白质在染色过程中在凝胶内扩散，通常染色需2小时。脱色液是同样的酸甲醇混合物，但不含染色剂，脱色通常需过夜摇晃进行。考马斯亮蓝染色具有很高的灵敏度，在聚丙烯酰胺凝胶中可以检测到0.1?g的蛋白质形成的染色带。考马斯亮蓝与某些纸介质结合非常紧密，所以不能用于染色滤纸、醋酸纤维素薄膜以及蛋白质印迹（在硝化纤维素纸上）。在这种情况下通常是用10的三氯乙酸浸泡使蛋
10、白质变性，而后使用不对介质有强烈染色的染料如溴酚蓝、氨基黑等对蛋白质进行染色。银染是比考马斯亮蓝染色更灵敏的一种方法，它是通过银离子（Ag+）在蛋白质上被还原成金属银形成黑色来指示蛋白区带的。银染可以直接进行也可以在考马斯亮蓝染色后进行，这样凝胶主要的蛋白带可以通过考马斯亮蓝染色分辨，而细小的考马斯亮蓝染色检测不到的蛋白带由银染检测。银染的灵敏度比考马斯亮蓝染色高10倍，可以检测低于1ng的蛋白质。糖蛋白通常使用过碘酸Schif试剂（PAS）染色，但PAS染色不十分灵敏，染色后通常形成较浅的红粉红带，难以在凝胶中观察。目前更灵敏的方法是将凝胶印迹后（下面介绍）用凝集素检测糖蛋白。凝集素是从植物
11、中提取的一类糖蛋白，它们能识别并选择性的结合特殊的糖，不同的凝集素可以结合不同的糖。将凝胶印迹用凝集素处理，再用连接辣根过氧化物酶的抗凝集素抗体处理，然后再加入过氧化物酶的底物，通过生成有颜色的产物就可以检测到凝集素结合情况。这样凝胶印迹用不同的凝集素检测不仅可以确定糖蛋白，而且可以得到糖蛋白中糖基的信息。三、简答题1、分离过程中初级阶段、中间阶段和精制阶段对分离技术的要求？答：1）初始阶段，主要任务在于从相对较大体积的抽提液中除去大量杂质,同时能浓缩样品和保障样品处于稳定的环境中.侧重点放在速度和处理量上，方法有匀浆和沉淀，膜过滤等-离子交换或亲和层析等。2）中间阶段，主要任务是进一步除去大
12、量杂质,但这些杂质与目的物的性质差异相对较小，所以选择分离方法要有较高的分辨率。侧重点放在分辨率和处理量上，进一步除杂，方法有离子交换，亲和，制备级等电聚焦。3）精制阶段，主要任务是除去微量杂质,使最后的产品获得高纯度.侧重点放在分辨率上。最后除杂，方法有得到高纯度离子交换，凝胶层析等。2、不连续PAGE中的浓缩效应原理答：样品浓缩效应：由于凝胶孔径不连续性，被分离物质在大孔径的浓缩胶与小孔径的分离胶之间的对移动速度的快慢差异很大，又因为缓冲体系离子成分及pH值的不连续性和电位梯度的不连续性，在浓缩胶中，由于被分离物的pI介与前导离子与尾随离子的pK之间，被夹在中间，共同向正极移动，形成极窄的
13、区带，因而在两种胶的交界处，样品迁移受阻产生了压缩成很窄的区带的浓缩效应。附资料：1）凝胶孔径不连续性：在3层凝胶中样品胶及浓缩胶为大孔径胶，在2层凝胶中样品/浓缩胶为大孔径胶，分离胶为小孔径胶；在电场作用下，被分离物在大孔径中移动遇到阻力小，移动速度快，当进入小孔径胶时，被分离物移动受到阻力大，移动速度变慢，因而在两种胶的交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。2）缓冲体系离子成分及pH值的不连续性：在浓缩胶中，由于被分离物的pI介与前导离子与尾随离子的pK之间，共同向正极移动，并被浓缩成极窄的区带里。3）电位梯度的不连续性：在不连续系统中，电位梯度的差异是自动形成的
14、。电泳开始后，由于前导离子的迁移率最大，就会很快超过被分离物，因此在快离子后面，形成一个离子浓度低的区域，这时就有了较高的电位梯度。这种高电位梯度使后面被分离物和尾随离子在前导离子后面加快移动。当前导离子、被分离物和尾随离子的移动速度相同时，建立一种稳定状态，这时在前导离子和尾随离子之间形成一个稳定而又不断向正极移动的界面，这就是样品被浓缩的中间层。（精缩1）不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳包含了两种以上的缓冲液成分,pH值和凝胶孔径,而且在电泳过程中形成的电位梯度亦不均匀.由此产生的浓缩效应3、重组蛋白通常在起N端加油His-Tag（多聚组氨酸的标签)可通过用IMAC多重组蛋白进行吸附，洗脱则是通过
15、增加咪唑浓度来实现，请解释IMAC对重组蛋白的吸附和洗脱原理。答：1）吸附：金属螯合亲和层析是通过蛋白质表面的氨基酸与固定化金属离子的亲和力的不同来对蛋白质分离的，IMAC中应用重组蛋白质表面的多聚组氨酸咪唑基与与固化的镍等金属离子强结合力，咪唑基的供电原子会金属离子结合形成复合物，取代原先结合的水分子或阴离子，这样就能使重组蛋白质分子结合在固体表面。2）洗脱：通过增加咪唑的浓度形成置换剂作用，新增的高浓度咪唑会置换与固定化金属离子结合的重组蛋白上的咪唑基，从而把重组蛋白从柱中先流出来，进而形成线性梯度洗脱。附IMAC简介：IMAC(生物技术)I是Im m obilzedetalAfinity
16、Chrom atgraphy的英文缩写中文翻译是：固相金属离子亲和色谱。1975年，Porth首次提出“固定化金属螯合亲和层析(Im m obilzedMetal-ChelatedAfinityChrom atgraphy)”的概念，首次成功地在琼脂糖上偶联了螯合剂亚氨基二乙酸(ID)钠。IDA的钠盐与金属离子如Cu+螯合后，可与生物分子如蛋白质结合，不同的蛋白质与金属离子结合力不同，从而将蛋白质分离。后来的研究表明经固定的金属离子不仅与基质以螯合形式结合，还可以离子键、共价键形式结合，或分散在固体基质中以胶体状存在。1983年Porth把凡是固定在基质上的金属(不管是否以离子状态存在)与溶质的亲和作用定义为“固定化金属亲和层析(IMAC)”Im m obilzedMetalAfinityChrom atgraphy:一种固化的镍等金属离子对带有6聚组氨酸的多肽进行亲和提取的色谱技术,4、简述免疫对流电泳的一般原理答：抗原抗体在一定的pH溶液中带有电荷，在电场的作用下可发生定向移动。将抗原
