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1、血浆、血清、体液蛋白质组学 研究及其应用,1,柳满然 Ph.D,E-mail: mliu-hncq,Tel: 6848-5184,蛋白组学基本知识,2,血浆、血清蛋白组学,唾液蛋白组学,尿液蛋白组学,脑、脊液蛋白组学,一、蛋白组学基本知识,3,4,蛋白质组(proteome = protein + genome): 一种细胞、组织或生物体完整基因组所对应的全套蛋白质 蛋白质组学（proteomics) 研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学,5,基本生物学问题 Post-translational modification Protein-protein interaction G
2、enome-Transcriptome-Proteome 临床应用问题 Disease marker-diagnosis Drug target-therapy,Proteomics,6,蛋白质组研究的基本技术,分离,Gel-based,Liquid-based,HPLC,FFE,SCX, RP, SEC,鉴定,MS,MALDI-TOF-MS,ESI-MS,MS-MS,2D-HPLC,MALDI-TOF-TOF,MALDI-Q-TOF,ESI-MS-MS,LC-ESI-MS-MS,计算机 技术,7,IEF: isoelectric focusing (等电聚焦),2-DE：Two-dimens
3、ional gel electrophoresis,第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离； 第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离， 把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开,HPLC：High-performance liquid chromatography or high-pressure liquid chromatography (高压液相色谱法),DIGE：2-D difference Gel Electrophoresis,基本缩略词,iTRAQ: Isobaric tag for relative and absolute quantitation 同位素标记相对
4、和绝对定量,8,质谱仪分为进样系统、离子源、质量分析器和检测器四部分。 离子源又分为： 电子轰击源 (Electron Ionization，EI) 化学电离源 (Chemical Ionization，CI) 场致电离源 (FI) 电喷雾电离源 (Electro Spray Ionization，ESI) 等,MS是单级质谱，适用于样品不是特别复杂的样品分析。 对于复杂样品，单级质谱会出现很多干扰峰，影响测定。,MS：Mass Spectroscopy (质谱),MS/MS是串联四级杆质谱，通过两个质量分析器间的碰撞室进行 一定能量的碰撞，选择性的扫描碰撞后得到的子离子碎片，不符合 一定质量
5、数的离子被抛弃，这就降低了背景噪音、大大提高了检测的 灵敏度和准确度。,基本缩略词,9,ESI-MS：Electro Spray Ionization-Mass Spectroscopy， 电喷雾质谱,MALDI-TOF-MS：Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization/ Time of Flight Mass Spectrometry 基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱， 是一种新型的软电离生物质谱,LC-ESI-MS/MS: 高效液相色谱-电喷雾串联质谱,MALDI-TOF-TOF：基质辅助激光解吸离子化-串联飞行时间质谱,MALDI-Q-TO
6、F：基质辅助激光解吸离子化-三级四级杆-飞行时间质谱,基本缩略词,10,PMF： Peptide Mass Fingerprinting (肽质量指纹谱)， 是蛋白质被识别特异酶切位点的蛋白酶水解后得到的 肽片段的质量图谱,蛋白质组学研究中，质谱测序一般采用两种方式： 一种是利用串联质谱 (MS/MS) 测序； 另一种是利用源后衰变 (PSD：post-source decay) 技术测序,基本缩略词,IPG(EF)：Immoblized pH gradients isoelectric focusing (固相pH梯度等电聚焦),11,PMF常用软件,Mascot: ,Profound: P
7、rowl.rockefeller.edu,PepIdent: www.expasy.ch/tools,ProteinProspector: Prospector.ucsf.edu,PepSea: 195.41.108.38,12,常用串联质谱检索工具,SEQUEST: Field.scripps.edu/sequest,PepFrag: Prowl.rockefeller.edu,ProteinProspector: Prospector.ucsf.edu,Mascot: ,13,基于2DE的差异蛋白质组分析技术流程,IEF:利用等电点差异分离Pr SDS-PAGE:利用分子量差异分离Pr,1
8、4,Provides a hard-copy record of separation Allows facile quantitation Separation of up to 3000 different proteins Highly reproducible Gives info on Mw, pI and post-trans modifications Inexpensive,Limited pI range (4-8) Proteins 150 kD not seen in 2D gels Difficult to see membrane proteins (30% of a
9、ll proteins) Only detects high abundance proteins (top 30% typically) Time consuming 30% of spots with multiple proteins from pI 4-7,2DE:Advantages & Disadvantages,15,传统的基于2DE的差异蛋白质组学分析技术,优点：,技术路线成熟,重现性和直观性好,费用较低,展示差异蛋白质的PI和Mw,缺点：,蛋白质共迁移(comigration)问题，不适合于很复杂的样品,线性动态范围较窄,强疏水性，强硷性，分子量过大(150kD）的 蛋白质受
10、到限制,16,基于Shotgun差异蛋白质组分析技术流程,iTRAQ-LC-MS/MS,17,18,Alleviate some limitations of the 2-DE/MS method Generally high throughput Protein identification and quantification is straightforward process is simple Can be used to ID post-trans. modifications,Requires more handling for sample isotopic labeling
11、Low reproducibility Requires high level expertise Showed biases for high Mr proteins and against certain types and classes of proteins,Advantages Disadvantages,Shotgun:Advantages & Disadvantages,19,Sensitivity and dynamic range of protein analysis methods,20,IPG(EF):Immoblized pH gradients isoelectr
12、ic focusing(固相pH梯度等电聚焦),建立于20世纪80年代，一种新型等电聚焦技术。利用一系列具有弱酸 或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物滴定，在滴定终点形成pH梯度并参与 丙烯酰胺的共价聚合。,优点：与传统两性电解质等电聚焦相比，具有分辨率更高、上样量更大。 分辨率可达0.001pH, 是目前分辨率最高的电泳方法,可用于等电点及其附近的蛋白质和多肽的分析、制备,特点：形成固定的、不随环境电场等条件变化的pH梯度,21,使用宽pH范围的胶条（pH 3-10）可以在同一块凝胶上看到样品中绝大多数的蛋白质。 将有重叠区域的窄pH梯度的胶条联合使用，也同样可以得到整个pH 3-10范围的结果。 因
13、为绝大多数蛋白聚焦在pH 3-10的中间区域，所以研究人员有时选用非线性梯度的胶条，这种胶条将两端的pH梯度压得很窄，却可以使中间区域的蛋白质得到较好的分离。 将窄pH梯度的线性IPG胶条重叠使用，效果要比用非线性胶条好得多，它可以检测出样品中更多的蛋白质斑点。,pH 梯度范围的选择,22,常用蛋白酶抑制剂,23,优点: 样品和对照之间的差异蛋白质展现在同一胶上,能直观可靠确定; 对isoform 的定量较准确; 比传统2DE动态范围有所增加. 缺点: 标记效率低只Lys的氨基的1%左右; 受限于2DE的分离能力; 受蛋白质在2DE上共迁移现象的影响,可能对复杂样品的isoform定量产生影响
14、.,2-D Difference Gel Electrophoresis (DIGE),24,Cys-labeling Modify before digest High probability of losing PTM,缺点: 只标记Cys，没有Cys的蛋白质得不到鉴定。纯化含Cys肽段时，有效肽段损 失巨大(达90%)。ICAT 分子量大，对于较小肽段影响数据库的搜索。2H, 1H 标记的肽段在反相分离时表现出轻微的洗脱时间不 一致现象，使得定量困难.,ICAT Workflow (技术流程) 补充,优点: 克服了2DE方法相应的缺点。 只鉴定含cys的肽段,减少了质谱分析的复杂程度。,
15、25,Isobaric labeling: N-term + Lys Modify after digest Requires MS/MS measurements,优点: 全标记，范围广，灵敏度高于ICAT。 可以做绝对定量。,缺点: 需要MS/MS分折后才能定量; 酶解后标记样品复杂程 度高; 只适合LC-MALDI-TOF/TOF或LC-MS/MS。,iTRAQ Workflow (技术流程) 补充,26,The mass difference between labelled (12C/13C) and unlabelled peptides are 105.0215Da/111.04
16、19 Da for each modified amino group: Lys + Protein N-term. Dm = 6.0204 Da/mod Lys residue,优点： 蛋白水平标记，全标记NH2，范围广，灵敏度高，有利于兼容其它蛋白 质的分离分法如2DE，SDS-PAGE等。所有的质谱都可以分析，包括离子阱。 缺点：需要用除Trypsin 以外的酶切，以提高蛋白质的鉴定率和定量率。,ICPL Workflow (技术流程) 补充,ICPL Reagent Structure,27,Acid Cleavable ICAT Reagents (ABI) 补充,优点：移去了亲和基因使标记的肽段分子量整体减小，提高了质谱分析中的效率和 降低了数据库搜索的复杂性。标记在C上使得共流出时间一致。 缺点：同ICAT试剂差不多。,28,SILAC Workflow (技术流程) 补充 (Stable isotope labeling with amino
