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1、实验四 细菌的生理生化试验及肠杆菌科的鉴别、理化因素及生物因素对微生物的影响,一、目的要求,掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的原理、方法、结果判定以及在诊断中的运用 熟悉大肠杆菌和沙门菌主要培养特性和常 规微生物学诊断方法 通过本实验加深理化因素及生物因素对微生物的影响的概念,二、实验材料,菌种：大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、巴氏杆菌 培养基：葡萄糖高层琼脂、普通琼脂斜面、水琼脂斜面、氧化-发酵培养基（小生化管）、普通平板、麦康凯平板、淀粉平板、三糖铁斜面、各类生化反应管等 器械：砂轮、试管架、接种环、接种针、灭菌吸管、灭菌刻度移液管、灭菌棉签、胶头、灭菌液体石蜡、酒精灯、废报纸
2、等,三、实验内容,1、细菌对空气（氧气）的需要 菌种：大肠杆菌、枯草杆菌 方法：用吸管将两种菌各加入两支己溶化的葡萄糖深层琼脂管中， 培养基：葡萄糖深层琼脂（己溶化） 2、细菌对营养的要求 菌种：大肠杆菌、巴氏杆菌 培养基：斜面（水琼脂、普通琼脂） 方法：划线的方法,（一）细菌的生理生化试验,3、细菌氧化型与发酵型（O/F）的测定 菌种：大肠杆菌、枯草杆菌 培养基：加有葡萄糖和指示剂（1%溴麝香草酚蓝）的微型发酵管 方法：用接种针将两种菌各加入两支发酵管中，从不同菌里各取一管加入灭菌的液体石蜡，37 正置培养。 产酸（浅绿色 黄色 ）,4、淀粉水解试验 菌种：大肠杆菌、枯草杆菌 培养基：普通营
3、养琼脂平板 方法：一块平板上，一边划大肠杆菌，一边划枯草杆菌，第二天长出菌后，在菌落上滴加碘液。 5、触酶（过氧化氢酶）试验 菌种：大肠杆菌、枯草杆菌 培养基：普通营养琼脂平板 方法：一块平板上，一边划大肠杆菌，一边划枯草杆菌，第二天长出菌后，在菌落上滴加H2O2,（二）肠杆菌科的鉴别（大肠杆菌&沙门菌）,肠杆菌科的生化试验,1、麦康凯琼脂平板 （乳糖、胆盐、指示剂：1%中性红） 方法：划线，分解乳糖 菌落变红 2、三糖铁琼脂斜面 （葡萄糖、蔗糖、乳糖、硫酸亚铁铵、指示剂：0.5%酚红） 方法：先划斜面再穿刺,3、糖分解试验 微量发酵管：葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖 方法：用接种针挑取菌种后接入
4、发酵管内，用报纸包好口，置培养箱培养。发酵糖产酸：指示剂溴甲酚蓝由紫色 黄色 4、吲哚（靛基质）试验 培养基：蛋白胨水微量管 原理：细菌分解蛋白质中的色氨酸产生吲哚，吲哚与对位二甲基氨基苯甲醛作用形成玫瑰吲哚而成红色。 方法：接种针接种，培养12-24 h后，加入试剂显色,5、甲基红（MR）试验 培养基：葡萄糖蛋白胨水 原理：甲基红试验： 分解葡萄糖产生丙酮酸，进一步分解为甲酸、乙酸、乳酸等使pH下降，含甲基红指示剂的培养基变红 6、VP试验：葡萄糖蛋白胨水 原理：某些菌发酵葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸经多脱羧、氧化等反应生成二乙酰，其与蛋白胨中精氨酸胍基作用产生粉红色化合物,7、枸橼酸盐（柠檬酸
5、盐）利用试验 培养基：Simmon氏枸橼酸钠微量发酵管 原理：细菌若能以枸橼酸钠为唯一碳源，磷酸铵为唯一氮源，则可利用枸橼酸钠产生碳酸盐，与利用铵盐产生的NH3反应，形成NH4OH，使培养基变碱，pH升高，指示剂溴麝香草芬蓝由草绿色变为深蓝色。 8、脲酶 培养基：尿素微量发酵管（指示剂：酚红） 原理：细菌分解尿素产生2分子NH4，使pH升高，指示剂变红。,9、硫化氢试验 培养基：营养琼脂中含FeSO4的微量反应管 原理：凡细菌能分解含硫氨基酸，产生H2S者，其所产生的H2S会使培养基中的醋酸铅或FeCl3形成黑色的硫化铅或硫化铁。 10、运动力试验 培养基：半固体琼脂微量反应管 方法：穿刺接种
6、,（三）理化因素及生物因素对微生物的影响,1.紫外线与杀菌试验 菌种： 大肠杆菌、枯草杆菌 方法：取营养琼脂平板2个，一个涂大肠杆菌，另一个涂枯草杆菌。在其涂有细菌的表面贴上以剪出不同图案的硬纸片，然后在紫外灯下距离30厘米照射20分钟，照射完毕将硬纸片取走盖回原来平皿盖，于37培养24小时观察结果。,2.药敏试验：圆纸片扩散法 菌种： 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌 培养基：营养琼脂平板 方法：,3.消毒剂抑菌和杀菌试验 菌种：大肠杆菌、枯草杆菌 方法：与药敏试验方法是一样的（纸片扩散法）,肠杆菌科细菌的鉴别,三糖铁琼脂斜面,斜面/底层,产气；H2S,糖发酵,葡萄糖,乳糖,蔗糖,甘露醇,MR,VP,靛基质,枸橼酸盐,脲酶,麦康凯,H2S,运动力,试验,结果,菌种,大肠杆菌,沙门菌,K / A,+(-) ; -,A=产酸（黄） K=产碱（红）,+ - +,
