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1、第12期 徐双双，等：硅胶柱色谱结合高速逆流色谱法分离纯化荷花中黄酮类化合物 1245 quercetin一3一O 一Dglucuronide；myricetin一3一O 一Dglucopyranoside；astragalin；Nelumbo nucif- era Gaertn 荷花(Nelumbo nucifera Gaertn)又名莲花、 中国莲、六月花神等，为睡莲科(Nymphaeaceae)莲 属多年生水生草本植物莲的花，资源丰富，系药食两 用之水生植物，性温味苦，能治疗跌打损伤、出血等 症，可内服、外用 。目前对荷花的研究报道主要 集中在荷花的品种分类及栽培技术方面。随着荷花 在生
2、活中的应用日趋广泛，对其活性成分的研究也 逐渐增多。林宣贤 的研究表明荷花中含有丰富 的氨基酸和矿物质成分。Yang等 应用高效液相 色谱一二极管阵列检测器质谱(HPLCDADMS)对 荷花的化学成分进行了分析，推断出了15种花色苷 和黄酮类化合物。郭兴峰等 的研究表明荷花花 瓣具有显著的抗氧化性，并分离鉴定了4种化合物。 分离纯化荷花中的功能成分是进一步进行活性研究 及其产品开发的必要步骤，因此建立相关成分的快 速有效的分离纯化方法具有重要的意义。 HO 高速逆流色谱法(highspeed countercurrent chromatography，HSCCC)是一种不需要固态载体 的液一液
3、分配色谱技术，具有操作简便、可避免因不 可逆吸附而引起的样品损失等优点，已被广泛应用 于天然产物的分离纯化中 。但是荷花中活性成 分多而且含量较低，直接采用HSCCC分离纯化所 得化合物的产量低，而传统的色谱法存在着耗时长、 溶剂消耗量大、分离效率低等缺点。本实验首先采 用硅胶柱色谱法对荷花中的黄酮类化合物进行富 集，然后采用HSCCC对已富集的黄酮类化合物进 行分离纯化，结合两种色谱方法的优点，实现了对荷 花中黄酮类化合物快速、有效的分离纯化，得到了3 个高纯度的黄酮类化合物槲皮素一3一O 一D一葡萄糖醛 酸苷(I)、杨梅素一3一O一 一D一葡萄糖苷(II)和紫云英苷 (III)(结构见图1
4、)，为荷花资源的进一步开发应用 提供了一定的参考依据。 OH 0H I：Quercetin3-O 一Dglucuronide II：Myricetin一3一O -Dglucopyranoside III：Astragalin 图1 3种黄酮类化合物的结构式 Fig1 Chemical structures of the 3 flavone compounds l 实验部分 11仪器与材料 GS10A型高速逆流色谱仪(北京艾美林科技有 限公司)、多层聚四氟乙烯螺旋管(直径23 mm，分 离体积230 mL，|B值为0508)、TBP泵(上海同 田生物技术有限公司)、8823B一紫外检测器(北京宾
5、 达英创科技有限公司)、30571 1记录仪(重庆川I仪 总厂有限公司)；Waters 600996高效液相色谱系 统(配有光电二极管阵列检测器(PDA)，美国Wa ters公司)；Varian INOVA一600核磁共振波谱仪(美 国Varian公司)；Agilent 1 100 Series 6320 iontrap 质谱仪(美国Agilent公司)。 硅胶柱色谱和逆流色谱用甲醇、氯仿、石油醚和 乙酸乙酯均为分析纯(天津市广成化学试剂有限公 司)，所用水为过滤蒸馏水；液相色谱用甲醇为色谱 纯(美国天地公司)，所用水为乐百氏纯净水；硅胶 (200300目)(青岛海洋化工厂)。新鲜荷花采集 于
6、济南市遥墙镇，经山东中医药大学李佳教授鉴定 为睡莲科莲属植物莲的花。 12荷花粗提物制备 新鲜荷花于室温下阴干。取干燥的荷花瓣5 ， 粉碎并过40目筛，加入95乙醇8 L，加热回流提取 2 h，过滤；重复提取3次，合并滤液，减压浓缩。将浓 缩液用水稀释至600 mL，依次用等体积的石油醚、乙 酸乙酯分别萃取3次，乙酸乙酯萃取液减压浓缩得乙 酸乙酯相粗提物905 g，4冰箱中保存备用。 13硅胶柱色谱初步分离 取乙酸乙酯粗提物40 g经硅胶柱色谱初步分 离，以氯仿一甲醇(100：1，60：1，40：1，20：1，10：1，5： 1246 色 谱 第29替 l，3：1，l：1)进行梯度洗脱，经HP
7、LC榆测合并相同 馏分，得F F jL 8个组分，经薄层色谱(TLC)显 包反应和HPLC检测，黄酮类化合物主要集rf1存组 分F f1，将其冷冻十燥，备用。 14 HSCCC分离 141 两相溶剂体系及样品溶液的制备 本实验选择溶剂系统为乙酸乙酯一乙醇一水一 酸 (4：1：5：0025，vvvv)，酉己制约1 000 mL，置于 分液漏斗巾，剧烈振荡使其充分混合后静置分层，平 衡后将卜下两相分开，上相为同定相，下相为流动 相，分别超声脱气30 min，备用。 称取13 rJ得到的组分F 150 mg，加入上下 相各5 mL，振荡使其完全溶解，备用。 142 分配系数( )的测定 根据史献报道
8、的 值测定方法 ，取2 mg F 样品置于10 mL试管中，加入 下相各2 mL，剧烈 振荡1 min，使样品充分溶解，静置分层，取上F卡甘 各5 L， HPLC分别进行检测，I 相峰面积为 ， F卡H峰而积为A ，K =A A，。 143 HSCCC兮离制备过程 将两卡H溶剂体系巾已超声脱气的上相(同定 丰u)以20 mLmin的流速泵入HSCCC分离管中，待 j一 充满螯个分离管后，调 主机转速达800 rmin l时针旋转，待转速稳定后，以2 mLmin流 速泵人下枉f(流动相)，检测波长为254 nm。 流 动卡H从主机口流出时，说明体系已达到流体动 学 平衡，此时将已准备好的10 m
9、L组分F 样品沣入 HSCCC仪，同时肝始采集数据，根据色谱图收集日 标成分 、 I5 HPLC条件 色谱相：Inertsil ODSSP柱(250 mm46 mill，5 txm) 柱温：25。流动相A：甲醇；流动相 B：01(vv)乙酸水溶液；线性梯度洗脱程序：0 25 min，30A90A；流速：10 mLmin；进样 量：l0 txL；检测波长：254 nm。 16化合物的结构鉴定 HSCCC分离得到的各化合物结构经过电喷雾 离子质谱(ESIMS)、核磁共振氧谱(。HNMR)和核 磁共振碳谱 CNMR)鉴定。质谱分析条件： 离 子馍式，样品通过流动注射泵进样，体积流量02 mLmin，
10、f燥气温度350；干燥器流最90 Lmin；雾化气 强241 Pa；毛细管电压4 kV；质量 扫捕范围mz 50l 200，实验前质量数经过校正。 核磁共振过程中溶剂为二甲基亚砜(DMSO)，【Ju甲 基硅烷(TMS)作为内标物质。 2结果与讨论 21 硅胶柱色谱条件的优化 分别考察_r仃油醚一乙酸乙酯、氯仿一f11醇洗脱 系统，经过TLC分析，结果(如罔2所示) 尔选用 油醚一乙酸乙酯系统时的成点忭卡分离效果均不 如氯仿-Ip醇系统，并且极性偏大的物质存 拖尾现 象，因此最终选择氯仿一 醇系统进 辞胶竹包爵 洗脱。 b 图2 荷花粗提物的硅胶薄层色谱图 Fig2 TLC chromatogr
11、ams of the crude extract of Nnci rn Developing solvents： a chloroformmethanol： b petroleum etherethyl acetate 22 HSCCC分离条件的优化 溶剂系统的选择是影响HSCCC分离的父键闪 素，采用分配系数K 值来衡量溶刹系统的选择是 否适合日标化合物的分离。一般而言对HSCCC 最合适的 值范围是0520 。按照14 lIJ 所述的方法首魁选HJ 油醚一乙酸乙酯一f醉一水、乙 酸乙酯一甲醇一水、乙酸乙酯一乙醇一水3个溶j=flJ体系， 分删测定目标化合物的 值 通过比较发现，f|I 标化
12、合物存乙酸乙酯一乙醇一水(4：l：5，vvv)溶剂 体系中的 。值更接近逆流色谱合适的 值范刚 根据目标化合物的性质及其在上面3个窬剂体系lf】 的 值，将溶剂体系优化为乙酸乙酯一乙醇一水一乙 酸(4：l：5：001，vvvv)，测定结果 示 、值均 有所减小，但仍然高于合适的 值范幽，所以将溶 剂体系进一步优化为乙酸乙酯一乙醇一水一乙酸(4：l： 5：0025，vvvv)，结果 示f1标化合物的 值 基本在适合的范围内(见 1)。 本实验还对流动相的流速进行了优化流速太 快分离效果 好，尤其是化合物I和化合物II小能 很好地分离；流速太慢会导致分离时间过长一最终 选择流速为20 mLmin，
13、使化合物得到很好的分 离，同时缩短了分离时问。 第12期 徐双双，等：硅胶柱色谱结合高速逆流色谱法分离纯化荷花中黄酮类化合物 1247 Petroleum ether-ethyl acetatemethanolwater(1：1：1：1vvvv) Ethyl acetatemethanolwater(4：1：5，vvv) Ethyl acetateethanolwater(4：l：5，vvv) Ethyl acetateethanolwateracetic acid(4：l：5：001v、Tv) Ethyl acetateethanolwater-acetic acid(4：1：5：0025v
14、vvv、 83 56 39 1 】 0 8 8 7 71 5 1 3O i9 112 74 67 54 2 9 For compounds IIII，see Fig 23 HSCCC分离纯化结果 选用溶剂系统乙酸乙酯一乙醇一水一乙酸(4：l：5： 0025，vv)，按照14节所述实验方法对13节制 备的样品进行HSCCC分离，根据HSCCC谱图手动 分段收集，分离结果如图3所示。通过HPLC检测， 阴影部分为纯度较高的馏分，分别将其合并为组分 IIII，减压浓缩干燥后称其质量分别为61、148、 202 mg，测定其纯度分别为970、954、963。 200 l5O 毫100 O 5O lO0
15、 50 200 t min 35O 图3 荷花中黄酮类化合物的高速逆流色谱图 Fig3 HSCCC chromatogram of flavone compounds from Nelumbo nucifera Gaertn Iquercetin一3一O 一Dglucuronide；IImyricetin一3一O一卢一Dglu copyranoside；III astragalin 24 HPLC条件的优化 分别考察了甲醇一水、乙腈一水和甲醇一01乙酸 水溶液作为流动相时各组分的分离情况。结果表 明，当流动相A为甲醇，流动相B为01乙酸水溶 液，线性梯度洗脱，025 min内A液从30上升至 90，流速为10 mLmin时，目标成分可以得到良 好的分离，组分F，及化合物槲皮素一3一O 一D一葡萄糖 醛酸苷、杨梅素一3一O一 一D一葡萄糖苷、紫云英苷的 HPLC谱图见图4。 25化合物的结构鉴定 l O 08 06 04 0 2 O 0 20 5 3 1 0 O5 0 O 06 04 O2 O 0 2 0 3 1 0 O5 化合物I：黄色粉末(甲醇)；ESIMS(mz)：4 图 0O 479M+H ； HNMR(DMSOd6，600 MHz)6： 760(1H，s，H-2，)759(1 H，d，巳厂：72 Hz，H Fig
