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1、当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一方面由于细胞密度过大，细胞与细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物枯竭和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。因此需要将培养细胞进行分离扩大培养，细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的这个过程称为传代(passage)或者再培养(subculture)。1)传代标准传代时间一般通过两个方面进行确定：一是在细胞培养过程中，当培养液由于pH值下降而呈现黄色时，表明细胞已经达到最大密度，需要换液或进行传代培养；二是观察细胞形态，健康细胞形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。初代培养的首次传代很重要，是建立
2、细胞系的关键时期。在首次传代时一般要特别注意以下3点：细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面之前，不要急于传代。原代培养时细胞多为混杂生长，上皮样细胞和成纤维样细胞并存的情况很常见。传代时不同的细胞有不同的消化时间，因此要根据需要，注意观察及时进行处理，并可根据不同细胞对胰蛋白酶的耐受时间不同而分离和纯化所需要的细胞。另外早期传代的培养细胞较已经建系的培养消化时间相对较长。吹打细胞时动作要轻巧，尽可能减少对细胞的损伤。首次传代时细胞接种数量要多一些，使细胞能尽快适应新环境有利于细胞生存和增殖。随消化分离而脱落的组织块也可一并传人新的培养瓶。2)生长周期和传代比例体外培养技术中所谓的传“代”概
3、念并不等于细胞生物学中“亲代细胞”与“子代细胞”中“代”的概念。传代培养的实质就是分离后再次培养，进行一次分离再培养称之为传一代，传代数可以衡量培养物的培养年龄。传代是细胞分裂造成的结果，细胞从一次分裂结束到下一次分裂结束为一个细胞周期，分为间期与分裂期两个阶段。细胞周期能准确表示细胞增殖速度。两次细胞分裂之间的时间也可以用细胞世代时间来表示，所以细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。正常细胞培养的世代数有限，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。传代代数与细胞的世代数(增殖代数)并不是同一个概念。在细胞培养时，所说的“第6代细胞”指细胞已经传代6次。以贴壁细胞为例，每传代一次，大概要倍增
4、36次，细胞要经历如下生长过程：游离期、贴壁期、潜伏期、对数生长期和停止期(平台期)。当细胞达到平台期时，就要进行传代培养，否则细胞会中毒，发生形态改变。甚至死亡。培养细胞有密度依赖和接触抑制的特点，细胞浓度过低，不易存活，表现为细胞在达到增长前有较长的滞留期；细胞浓度过高，发生接触抑制后生长迟缓甚至死亡，所以传代比例通常按1:21:4的稀释度进行。传代后细胞的接种浓度一般为510的5次方/mL。细胞传代方法1)概述2)根据不同细胞采取不同的培养细胞传代方法。悬浮生长的细胞可以用直接吹打或离心分离后传代，或自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。贴壁生长的细胞用消化法传代，部分贴壁生长的细胞用直接吹
5、打即可传代。3)细胞传代培养时常用的酶为胰蛋白酶，它可以破坏细胞与细胞、细胞与培养瓶之间的细胞连接或接触，从而使它们之间的连接减弱或完全消失。经胰蛋白酶处理后的贴壁细胞在外力(如吹打)的作用下可以分散成单个细胞，再经稀释和接种后就可以为细胞生长提供足够的营养和空间，达到细胞传代培养的目的。2)方法(1)贴壁细胞的消化法传代吸除或倒掉瓶内旧培养液。向瓶内加入适量消化液(胰蛋白酶或与EDTA混合液)，轻轻摇动培养瓶，使消化液流过所有细胞表面，然后吸掉或倒掉消化液后再加l2 mL新的消化液，轻轻摇动后再倒掉大部分消化液，仅留少许进行消化。也可不采用上述步骤，直接加消化液进行消化。最好在37或25 q
6、C以上室温环境下进行消化。消化25 min后把培养瓶放置在显微镜下进行观察，发现细胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即终止消化。吸除或倒掉消化液，如用EDTA消化，需加Hanks液数毫升。轻轻转动培养瓶把残留消化液冲掉，然后再加培养液。如仅用胰蛋白酶可直接加少许含血清的培养液，终止消化。用弯头吸管，吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，吹打过程要顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有底部都被吹到。吹打时动作要轻柔不要用力过猛,同时尽可能不要出现泡沫，这些都会对细胞有损伤。细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。计数，分别接种在新的培养瓶内。(2)悬浮细胞的传代因悬浮生长细胞不贴壁，故传代时不必采用
7、酶消化方法，而可直接传代或离心收集细胞后传代。直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清吸掉1/2-2/3，然后用吸管吹打形成细胞悬液后，再传代。悬浮细胞常采用离心方法传代，即将细胞连同培养液一并转移到离心管内，8001000 r/min离心5min，去除上清，加新的培养液到离心管内，用吸管吹打形成细胞悬液，然后传代接种。(3)半悬浮细胞的传代半悬浮细胞部分呈现贴壁生长现象，可不经消化处理直接吹打使细胞从瓶壁上脱落下来，而进行传代。但这种方法仅限于部分贴壁不牢的细胞，如Hela细胞等。直接吹打对细胞损伤较大细胞也常有大量丢失，因而绝大部分贴壁生长的细胞均需消化后，才能吹打传代。细胞系的维持细
8、胞系的维持是培养工作重要内容。通过换液、传代、再换液、再传代和细胞冻存实现细胞系的维持，但对每一个细胞系来说都有其自身特点。要做好细胞系的维持必须注意以下4点：细胞系档案要记录好，如组织来源，生物学特性，培养液要求、传代、换液时间和规律，细胞的遗传学标志，生长形态，常规病理染色的标本等。这些记录对于保证细胞正常生长，保持细胞的一致、观察长期体外培养后细胞特性的改变都有十分重要的意义。因此，无论在索取新细胞系还是自己建立新细胞系时都要尽可能把上述资料收集齐全。细胞系的传代、换液一般都有自身的规律性，因此在维持传代时要注意保持其稳定的规律性，这样可以减少由于传代时细胞密度的频繁增减或换液时间的不规
9、律而导致细胞生长特性发生改变，影响以后细胞实验。多种细胞系维持传代，要严格操作程序，以防细胞之间的交叉污染。传代时所用器械要编号或做好标记，严禁交叉使用.每一种细胞系都应有充足的冻存储备，防止由于培养细胞污染等因素造成细胞系的绝种；另外，二倍体细胞等有限细胞系如果暂时不用，最好冻存，以免传代太多，造成细胞衰老或发生改变。培养细胞的纯化体外培养细胞源于动物机体，而机体内的细胞都混杂生长，每一种组织都有血管和间叶组织，因此，从体内取得的培养材料所做的原代培养，绝大多数都是各种细胞混合生长。其主要表现为两大类，即上皮样细胞和纤维样细胞。在体外培养的细胞中即使都是纤维样细胞或上皮样细胞，它们也有种类的
10、不同，如纤维样细胞包括成纤维细胞、肌细胞、骨细胞、滑膜细胞等。而利用体外培养细胞进行实验研究都要求采用单一种类细胞，这样才能对某一细胞的功能、形态等的变化进行研究，因此培养细胞的纯化就成为体外培养细胞实验研究的重要一步。细胞的纯化一般分为自然纯化和人工纯化两大类。可根据不同细胞种类、来源、实验要求和目的而选择不同的纯化方法。下面主要介绍一些基本的方法。1)自然纯化自然纯化即利用某一种类细胞的增殖优势，排挤其他细胞生长，靠自然的增殖潜力最后留下生长优势细胞，去除其他细胞，达到细胞纯化的目的。但这种方法常无法人为的选择细胞，时间长，多数情况下，剩下的都是成纤维细胞，因此，仅有些恶性肿瘤细胞可以通过
11、此方法，自然纯化而建立细胞系。2)人工纯化利用人为手段造成对某一细胞生长有利的环境条件，抑制其他细胞的生长，从而达到纯化细胞的目的。(1)酶消化法概述：由于上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，成纤维细胞对胰蛋白酶比较敏感，而上皮细胞对胰蛋白酶的耐受性较高，因此，在消化培养细胞时，成纤维细胞先脱壁，而上皮细胞要消化相当长的时间才脱壁，特别是原代培养和培养早期，这种差异尤为明显，因而可以利用这种差异采用多次差别消化方法，将上皮细胞和成纤维细胞分开达到纯化细胞的目的。方法：采用普通消化传代方法，将0.25胰蛋白酶注入培养瓶内两次，每次加1 mL(25 mL培养瓶)，稍加摇动让胰蛋白酶流过所有
12、细胞表面，然后倒掉。盖好瓶盖，将培养瓶放在倒置显微镜下观察，发现纤维样细胞变圆，部分脱壁，立即加入2mL有血清培养液，终止消化。用弯头吸管轻轻吹打纤维样细胞生长的区域(可事先在显微镜下用记号笔在培养瓶上画出记号)：吹打过程中不要用力，也不要吹上皮细胞生长区域。吹打结束后，再用少量培养液漂洗一遍，然后加入适量培养液继续培养，也可重复上述操作再进行一次，或隔几日后或下次传代时，再进行上述操作。经过几次处理可以将成纤维细胞去除或将两者分开。(2)机械划除法概述：原代培养成功后，上皮细胞和成纤维细胞多数都同时出现，混杂生长。这种混杂生长常常分区呈片，每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上：因此
13、可以采用机械的方法去除不需要的细胞的区域，而保留需要的。方法：将要纯化细胞的培养瓶，放在倒置显微镜监视下进行。用弯头滴管在不需要生长的细胞区域推划，使细胞脱壁悬浮在培养液中，注意不要伤及所需细胞；推划后用培养液冲洗两次，即可加培养液继续培养；数日后如发现不需要的细胞又长出，可再进行上述操作，这样反复多次可以纯化细胞。操作过程要严格无菌操作，防止污染。(3)反复贴壁法概述：成纤维细胞与上皮细胞相比，其贴壁过程快，大部分细胞常能在1030 min完成附着过程(但不一定完全伸展);而上皮细胞大部分在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起。利用不同细胞贴壁速度不同的特点，经过反复贴壁，可以将早期
14、传代培养中的成纤维细胞和上皮细胞分开。方法：将细胞悬液接种到一个培养瓶内(最好用无血清培养，因为在无血清支持下，上皮细胞贴壁更慢)静置20 min；在显微镜下观察，见细胞部分贴壁，稍加摇荡也不浮起时，将培养液连同尚未贴壁细胞一起倒出或吸到另一培养瓶；继续培养或重复上述操作，将上皮细胞和成纤维细胞逐步分隔开。(4)克隆法在同一细胞系中，存在不同的细胞株，它们的功能和生长特点仅略有不同，要纯化出某一种细胞，用上述方法常不能将同一细胞系的不同株分开，可采用细胞克隆的方法。具体过程是采用细胞克隆法将细胞分成单个细胞，使之分别生长成克隆，然后对每一克隆进行测试，选择出所需要的克隆。(5)培养基限定方法某些细胞在生长过程中必须存在或去除某种物质，否则将无法生长，而其他细胞与之相反。可以利用这种技术来纯化细胞。如杂交瘤技术中常用的HAT培养液，就用来筛选杂交瘤细胞而抑制其他细胞。(6)流式细胞仪分离法流式细胞仪可根据细胞核酸含量、某些物质含量或细胞结构大小等参数来将细胞分离成不同的群体。
