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1、液相色谱仪日常维护及维修 上海市药检所化学室 李建华 液相色谱仪结构组成 流动相 脱气机 泵 进样器 柱温箱 柱后衍生化装置 检测器 流动相试剂 有机相：光学纯或HPLC级 水：必须是新鲜的去离子水 其它试剂：分析纯或更高 注意：使用前均用相应的滤膜滤过（0.45m） 溶剂使用注意点 滤膜 聚四氟乙烯膜-双相 尼龙66膜可过水和大多数有机溶剂 醋酸纤维素滤膜适用于水性溶液（尤其是蛋白质和蛋白质 相关样品） 再生纤维素滤膜适用于水溶性生物样品和有机溶剂。 注意：1.水膜和有机滤膜千万不可混用！ 2.分别滤过的水相与有机相的混合。 液相常用的溶剂过滤装置液相常用的溶剂过滤装置 溶剂过滤器检查 溶剂
2、过滤器清洗 垂熔玻璃滤器： 不锈钢烧结滤器：可用超声清洗 流动相脱气 脱气作用 脱气方式原理：1. 低压脱气 2.氦气脱气 3. 超声波脱气 流动相脱气作用 流动相脱气方式 1低压脱气法 电磁搅拌水泵抽空，可同时加温或向溶剂吹 氮。由于抽空和加温都会导致溶剂蒸发，对二元或多元洗 脱液的组成会有影响，故此法适用于单一组成的洗脱液。 2氦气脱气法 将氦气通过一圆筒过滤器通入冲洗剂中，在 o5kscm2压力下保持10一15min，用氦气的小气泡将 溶于溶剂中的空气带出。此法简单方便，适用于所有洗脱 液，只是氦气较贵。 3超声波脱气法 将洗脱液瓶置于超声波清洗槽中，以水为 介质超声脱气。一般500m1
3、溶液约需20一30min。此法方 便，适于采用。 三种脱气方式比较 脱气方式脱气效果能否在线对基线漂移影响 氦气脱气好能噪音较低，易基线漂移 超声脱气一般（需加真空）不适合/ 真空脱气较好能噪音、基线漂移均较小 在线脱气应用细节 氦气脱气：氦气起始流速一般设置30ml/min左 右，维持时间根据流动相体积来确定，分析时维 持流速一般设置5ml/min左右。 真空在线脱气：脱气机每个通道的流动相相对 固定，这样可避免相互干扰。更换溶剂排液要充 分，并且要注意脱气机最大流速。 真空脱气机联接 真空脱气机工作原理 脱气机维护 溶剂过滤器清洗 溶剂更换 不用通道溶剂更换或封堵 排液时要根据脱气机类型选
4、择流速、时间。 注意：由于大部分连接头和 芯子都是塑料的，拧紧时千万不 可太用力。 脱气机故障 脱气机故障原因判断 真空泵故障：短接真空泵进、出口管路 真空腔漏 连接密封性 溶剂 半透膜破裂 泵 分类：1.作用原理 2.输液方式 应用：单元泵 多元泵：1.低压混合：比例阀 2.高压混合：混合器 液相色谱的溶剂输送系统 溶剂A溶剂B 电磁阀A电磁阀B 混合室 泵 溶剂A溶剂B 高压泵A 高压泵B 混合室 低压、高压混合比较 低压混合四元泵工作原理 低压混合四元泵结构 Agilent 1100泵结构 密封垫冲洗装置 密封垫冲洗应用 泵应用细节 使用的流动相要与泵的压缩因子配对。特别是用 梯度混合时
5、。 对四元泵比例阀来说,密度大的流动相放下方（常 规是水相溶剂应放在下方,有机溶剂放在上方）。 二元或四元泵的冲程调小可获得较好的混合效果 ，但会影响密封垫寿命。 梯度或比例阀的准确性可测定。 泵维护 泵维护 不同用途时溶剂选择 目的溶剂注释 安装后异丙醇排除系统中空气效果最好 正相与反相间转换异丙醇与两相溶剂互溶性均较好 安装后甲醇或乙醇如没有异丙醇，可代替（ 第二种选择） 使用缓冲液后冲洗系统重蒸水再溶解缓冲液结晶效果最 好 更换溶剂后（反相）重蒸水防止缓冲液结晶析出 正相密封垫安装后异丙醇-己烷（5：95）润湿效果好 液相泵后常用在线过滤器 带可更换滤芯的在线过滤器图例 样品过滤器溶剂过
6、滤器 过滤器元件 泵维护 多通道梯度阀 进、出口单向阀清洗 出口过滤阀清洗或更换 Seal Wash的清洗及密封垫更换 泵密封垫更换 石英柱塞杆清洁、更换 维护信息 密封圈拆洗 泵密封圈更换 泵密封圈更换注意点： 1.柱塞用牙膏棉球擦洗一下。 2.密封圈在甲醇中浸泡5分钟用专用工具安装。 3.泵座用水清洗一下。 4.密封圈（注意不同类型） 密封垫磨合 常见泵故障和诊断 多通道梯度阀漏 泵前出现气泡 压力不稳 泵不出流动相（松开purge阀） 进、出口单向阀漏或堵塞 压力高 泵压力不正常原因 气泡 进、出口单向阀故障 密封垫或柱塞杆磨损 管路渗漏或堵塞 比例阀故障 压力传感器故障 比例阀混合盐浓
7、度太高 进样器 手动进样器：1.垫塞进样 2.阀进样 自动进样器： Manual Injector Valves - Six Port Fixed Loop To Waste Sample Loop (Fixed Volume) From Pump To Column Sample Syringe Load Inject To Column Common Problems nImproper syringe size or type nValve Blockage nInjection-port leakage nSample carryover nCross-port leaks 手动进样阀
8、手动进样阀 手动进样阀手动进样阀 Front View Inject Rear View Load - Inject Sample Loop 手动进样器操作原理 手动进样器操作原理 手动进样器 手动进样器：六通阀 进样顺序：INJ时插针，LOAD时注射，再加INJ时运行 排空管翘起高度要与针口平行 六通阀接口最好用Rheodyne专用接头，减少死体积 若用定量管来定量，则多进样（定量管体积1.5倍以上） 转子密封圈若漏，可先将三个定位螺丝拧紧5-10度（如 无效再更换转子） 在HPLC系统中使用的注射器针头有别于气相色谱，是平 头注射器。一方面，针头外侧紧贴进样器密封管内侧， 密封性能好，不漏
9、液，不引入空气；另一方面，也防止 了针头刺坏密封组件及定子。尽快转动阀，不能停留在 中途，否则过高的压力在柱头上引起损坏。 六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两 种。使用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积 的75，并且要求每次进样体积准确、相同；使用完全装 液法进样时，进样量最少为定量环体积的3至5倍，即 20l的定量环最少进样60至100l的样品，这样才能完 全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度 及重现性。 六通阀的使用 手动进样器维护 防止微粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨 损。为防止缓冲盐和其它残留物质留在进 样系统中，每次结束后应冲洗进样器，通 常用不含盐的
10、稀释剂、水或不含盐的流动 相冲洗，在进样阀的Load和Inject位置反 复冲洗，。 手动进样器维护 手动进样器维护 手动进样器维护 转子密封垫选择 Agilent 1100自动进样器工作原理 Agilent 1100自动进样器工作原理 自动进样条件优化 进样污染处理 进样污染处理 自动进样器维护 进样座与针外壁要在诊断中的change needle状态下， 用水棉球及异丙醇棉球擦洗。 若常用缓冲溶液，计量泵内的柱塞与密封圈，六通阀上 的定子与转子密封圈要定期清洗。 若六通阀的转子密封圈有划痕，可将三个固定螺丝各拧 紧5到10度。 机械部分要保持清洁，若有灰尘需取出机械臂，除尘并 加稀牛油。
11、定量环要在Configure中定义，如100ul、500ul、900ul 、1500ul。 自动进样器维护 更换针及针座 更换转子密封圈 转子密封圈磨损判断： 自动进样器常见故障 柱温箱 连接头、管线 预热器 柱温箱 色谱柱 HPLC连接用的接头 零死体积接头 不能使用的接头 HPLC常用的色谱柱接头 0.090 in. 0.130 in. 0.090 in. 0.170 in. SwagelokWaters Parker Rheodyne ValcoUptight 0.090 in. 0.080 in. Troubleshooting LC Fittings, Part II. J. W.
12、Dolan and P. Upchurch. LC/GC Magazine 6:788 (1988) 连接管线 柱温箱维护 进出柱温箱的管路一定要嵌入槽口内，以免折断管路。 予热器要定期清洗，以防污染及堵塞。 拆卸柱子要用两个板手，以免毛细管折断。 使用peek管，要注意压力不要超过200bar，否则管子会弹出 。 温度设置比室温低时，要注意有水冷凝析出。 色谱柱分类 预柱： 分析柱 预柱 液相色谱的预柱按其安装位置可分为两种。 一种是安装在泵和注射器之间，目的是使校免受腐蚀性的或受污染了 的流动相的损害。腐蚀性的流动相逐渐溶解预柱卞的硅胶填料，使其在 到达分析柱之前就已变得饱和因此不损害分析
13、拄。另一方面，预柱可 用来收集流动相中的痕量杂质。在注射口前收集杂质比在注射口后往 前)收集杂质好，因为在后一种情况下，有可能改变柱的选择性或产生鬼 峰-在有梯度系统的情况下，这种预柱可放在泵的出口，混合槽的前面， 达一类预拄的填料部宜有一定的容量并易于填充。 另一种预柱安装在注射口和分析柱之间，这种预柱主要用来防止脏的 样品和已损坏的垫或其它材料进入分析柱。这种预柱是要通过样品的， 所以与第一种不同，要求较高，它必须填充得很好，柱效较高，并且在 功能上能和分析往匹配。另外，不管是和注射口的联接还是和分析柱的 联接，都要注意尽量减少死体积，因为它是分析柱的一个延伸。 预柱和保护柱 由泵输送的
14、流动相 预柱 进样器 保护柱 分析柱 至检测器 截留或 浓缩柱 色谱柱的安装 Whats needed: The right connectors to avoid any future leak. Guard column to protect the main column The right tools 标准不锈钢分析柱 Capillary S.S. Filter Frit 2 um Pore Size Column Packing Authoring Division Name File Name Security Notice (if required) 卡套柱：带可重复使用的末端
15、接头和一体化的保护柱柱芯 无保护卡套柱芯 有保护卡套柱芯 带Techtron 卡套柱芯的 Zorbax 保护柱 Techtron 柱芯 含一体化的滤芯 min5101520253035 mAU 140 142.5 145 147.5 150 152.5 155 157.5 160 min5101520253035 mAU 140 142.5 145 147.5 150 152.5 155 157.5 160 BDS ODS Hypersil 250 - 2 mm with integrated Guard Column BDS ODS Hypersil 250 - 2 mm without Guard Column 2 mm 内径卡套柱有和无保护柱的比较 高效液相色谱柱发展史 19世纪70年代中期，HPLC仪开始出现，主要填料：10 m 的无定型硅胶颗粒。 70年代后期，发展了反相液相色谱。 80年代，HPLC 被广泛应用于化合物的分离，主要填料：粒径为5 10 m 球形 硅胶。 90年代早期，粒径为 5 m 的高纯硅胶，即所谓的 B 型硅胶被发展，并成为这个 行业填料的标准，这种 B 型硅胶含有微量的金属。 90年代后期，为了满足快速分离的需求，发展了 3 m 或 3.5 m 的球形硅胶，其 作用和性能逐渐的获得了人们的认同和接受。 21世纪早期，为适应超快速的分离要
