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1、主讲人：刘立新 lxliu 西安电子科技大学 1 第 5 章 生物光子学成像技术 2 5.1 光学成像 5.2 光学显微技术 5.3 荧光显微技术 5.4 激光扫描共聚焦显微技术 5.5 多光子激发荧光显微技术 5.6 全内反射荧光显微技术 5.7 荧光共振能量转移成像技术 5.8 荧光寿命成像显微技术 5.9 光学相干层析成像技术 5.10 非线性光学成像技术 5.11 生物光子学成像技术的发展趋势 本 章 内 容 3 荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET） 工作原理： 一对合适的荧光物质（可以是不同分子或同一分子的不同生色
2、团 ）可以构成一个能量供体(donor) 和能量受体(acceptor) 对，它 们之间由于偶极-偶极的相互作用，激发供体分子的光子能量h 能够被传递至受体分子，而后受体分子通过发射出光子h(h h) 而松弛，这个过程就是荧光共振能量转移。 以供体的激发光激发，供体产生的荧光强度比它单独存在时要低 得多，而受体发射的荧光却大大增强，同时伴随供体的荧光寿命 的相应缩短和受体的荧光寿命的相应拉长。 5.7 荧光共振能量转移成像技术 4 FRET发生条件： 1）供体和受体之间达到合适的距离内(110 nm)，能 量转移效率和分子之间距离的六次方成反比关系； 2）供体与受体的跃迁偶极有一定的相对取向；
3、 3）供体的发射光谱与受体的吸收光谱有相当程度的重叠 。 FRET成像是生物医学研究的重要手段之一。它应用于蛋 白质-蛋白质间相互作用，钙新陈代谢、蛋白酶活性、和 高吞吐量放映化验等研究。 5.7 荧光共振能量转移成像技术 5 CFP/YFP FRET能级图级图 5.7 荧光共振能量转移成像技术 CFP受光激发发后便发发射光； CFP离YFP的距离大于10nm； YFP没有受到激发发，因此也不发发射光。 CFP受光激发发后但没有发发射光； CFP与YFP的距离非常接近（1-10nm）； YFP没有受到激发发，但发发射光。 6 (供体） (受体） (效率） 5.7 荧光共振能量转移成像技术 7
4、已知的FRET对对： 染料类类：FITC/Rhodamine、Alexa488/Cy3、Cy3/Cy5、FITC/Cy3 荧荧光蛋白类类：CFP/YFP、BFP/GFP、BFP/YFP、CFP/DsRED、GFP/DsRED 混用：GFP/Rhodamine 7 5.7 荧光共振能量转移成像技术 8 8 5.7 荧光共振能量转移成像技术 9 9 10 FLIM-FRET From: Phizicky E, Bastiaens PIH, Zhu H, Snyder M, Fields S. “Protein analysis on a proteomic scale”, Nature, 422,
5、 208-215,2003 Figure 3: Principle of optical detection of protein post- translational modifications on a cell microarray 10 FRET目前应用的几个热点： FRET技术及其应用向亚细胞及单分子观测水平发展 信号转导通道（网络）的亚细胞水平定位 生理事件过程中信号转导过程的细节、以及调控过程 的时空关系 利用FRET技术追踪在体水平生命过程 5.7 荧光共振能量转移成像技术 1111 5.1 光学成像 5.2 光学显微技术 5.3 荧光显微技术 5.4 激光扫描共聚焦显微技术
6、 5.5 多光子激发荧光显微技术 5.6 全内反射荧光显微技术 5.7 荧光共振能量转移成像技术 5.8 荧光寿命成像显微技术 5.9 光学相干层析成像技术 5.10 非线性光学成像技术 5.11 生物光子学成像技术的发展趋势 本 章 内 容 12 荧荧光寿命是指分子受到光脉冲激发发后返回基态态之前在激发态发态 平均停 留的时间时间 ，定义为荧义为荧 光强度衰减到初始值值的1 / e (37% ) 时时所需要 的时间时间 ，通常小于100ns 。 通过扫过扫 描测测量样样品不同位置处处的荧荧光寿命成像，能够够反映组织组织 微 环环境，如分子所处处微环环境中的许许多生物物理、生物化学参数如pH
7、值值、离子浓浓度(如Ca+ 、K+等) 、氧压压、溶液疏水性及猝灭剂灭剂 (如碘 化物、丙烯酰烯酰 胺) 等的分布。 5.8 荧光寿命成像显微技术 Exponential decay of fluorescence 13 荧光寿命成像显微技术（Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, FLIM）的特点： 荧光寿命对荧光分子局部环境高度敏感； 荧光寿命不受荧光强度、染料浓度的影响，并且最大程 度上与荧光剂的光致漂白无关； 尽管某些荧光团的荧光谱相似，但在不同的环境下其寿 命不同，因此寿命是更加敏感的环境参量； 由于供体能量转移到受体上，因此只需要测量供体
8、的荧 光寿命，就可以测量其能量转移（FRET）。 5.8 荧光寿命成像显微技术 1414 Photochem Photobiol Sci 4, 13-22, 2005 利用荧光寿命能够测量利用荧光寿命能够测量 折射率，pH，Ca2+浓度等长寿命-无 FRET 短寿命-有FRET 分子的旋转动力学 5.8 荧光寿命成像显微技术 1515 5.8 荧光寿命成像显微技术 1616 外部因素则包含多方面，主要有： 光照射是致荧光淬灭的最常见原因，； 荧光物质的分子与外部分子(或离子)形成非 荧光的化合物； 共振能量的转移； 溶剂种类、pH值及温度等环境条件。 荧光淬灭是指荧光分子由内部因素和外部因素同
9、时 作用造成的不可逆破坏。内部因素主要是分子从激 发态回到基态以非辐射跃迁形式释放能量。 Quenching & Bleaching Philippe I. H. Bastiaens and Anthony Squire. trends in CELL BIOLOGY (Vol. 9) February 1999 = (m+ p )/ 2 p= phase of fluorescence m=modulation depth of fluorescence 荧光寿命测量：时域和频域 5.8 荧光寿命成像显微技术 1717 FLIM实现方法 = (m+ )/ 2 = phase of fluor
10、escence m=modulation depth of fluorescence 5.8 荧光寿命成像显微技术 Time (ns) I Excitation Emission =2 a b AB 调制激发和发射光的直流成分分别为A和B；调制振幅分别为a和b；发射光相 对于激发光的相位延迟为，解调系数为M。 相位寿命： 调制寿命 ： 调调制频频率f， =2f 5.8 荧光寿命成像显微技术 频域法测量荧光寿命原理图 = (M+ )/ 2 19 荧光寿命的时域测量方法： 门控像增强器（Gated image intensifier ） 时间相关单光子计数器（ Time Correlated Si
11、ngle Photon Counting，TCSPC） 扫描相机（Streak camera） 5.8 荧光寿命成像显微技术 2020 Gated image intensifier 基于门控像增强器的FLIM 5.8 荧光寿命成像显微技术 2121 from W.Becker著，屈军乐译，高级时间相关单光子计数技术，科学出版社，2009 TCSPC测测量寿命 5.8 荧光寿命成像显微技术 2222 TCSPC Principle from W.Becker著，屈军乐译，高级时间相关单光子计数技术，科学出版社，2009 5.8 荧光寿命成像显微技术 2323 5.8 荧光寿命成像显微技术 24
12、 时间相关单光子计数法装置示意图 24 Sample TCSPC Card Fluorescence Decay Analysis Ti:Sapphire Laser Dichroic Fluorescence Lifetime Image Emission Filter Detection MCP-PMT Scanner Leica TCS SP2 Becker & Hickl SPC 150 利用TCSPC技术术的共焦FLIM技术术 5.8 荧光寿命成像显微技术 2525 深大光电电工程学院TCSPC-FLIM系统统 5.8 荧光寿命成像显微技术 2626 扫描相机工作原理 5.8 荧光寿
13、命成像显微技术 2727 X (position) Y (time ) 0ns 5ns 基于扫扫描相机的 FLIM: Streak-FLIM of Hamamatsu FLIM optics Streak Camera 5.8 荧光寿命成像显微技术 2828 基于扫扫描相机的FLIM: STSR-MMM 5.8 荧光寿命成像显微技术 2929 基于扫扫描相机的FLIM: STSR-MMM of SZU Scan optics Streak camera 5.8 荧光寿命成像显微技术 3030 用双光子FLIM测量氯离子浓度 FLIMFLIM的应用的应用 5.8 荧光寿命成像显微技术 3131
14、FLIM的应用-区分有相互作用和没有相互作用的蛋白分子 5.8 荧光寿命成像显微技术 3232 FLIM的应用-研究蛋白分子之间的相互作用 5.8 荧光寿命成像显微技术 3333 FLIM的应应用-测测量 组织组织 中的pH 5.8 荧光寿命成像显微技术 3434 FLIM的应应用-AMD的检测检测 及诊诊断 5.8 荧光寿命成像显微技术 3535 5.1 光学成像 5.2 光学显微技术 5.3 荧光显微技术 5.4 激光扫描共聚焦显微技术 5.5 多光子激发荧光显微技术 5.6 全内反射荧光显微技术 5.7 荧光共振能量转移成像技术 5.8 荧光寿命成像显微技术 5.9 光学相干层析成像技术
15、 5.10 非线性光学成像技术 5.11 生物光子学成像技术的发展趋势 本 章 内 容 36 X-ray 成像 磁共振成像 计算层析CT 超声成像 光学成像技术 有损伤 分辨力 100 m 系统庞大 价格昂贵 无损伤 分辨力 1 增益： 5.9 光学相干层析成像技术 4747 数据采集与处理 在光电探测器输出电信号的处理上，要经过以下几个步骤： 首先要经过带通滤波器将直流和高频光强滤除，只允许外差调制信号通过； 然后再进行信号包络检测（解调：低通或锁相放大）； 最后利用高速数字采集系统将模拟电信号转换成数字信号，并传输到计算机 系统进行图像重建和显示。 5.9 光学相干层析成像技术 4848
16、光纤纤式OCT 5.9 光学相干层析成像技术 49 50:50光纤纤耦合器 光纤OCT的特点: 灵活性 可携带 易于集成到其他医 学成像仪器，例如： 内窥镜 49 OCT的优势优势 分辨率高： OCT图像轴向分辨率和横向分辨率互不相关，能提供独 立于横向分辨率的近似于微米量级的轴向分辨率。 高灵敏度：由于引入了外差探测，其探测灵敏度远远高于直接探测 。典型的OCT系统可达到90dB100dB的探测灵敏度，能够探测来 自高散射生物组织23mm深度的光学信号。 实时成像 结构简单、成本低廉： OCT成像装置的核心是迈克尔逊干涉仪，成 像原理简单，制造成本相对较低，各种光学器件和检测设备易于在 市场中购买。 与导管和内窥镜兼容：基于光纤的设计可以使OCT系统直接和导管 或者内窥镜结合起来。 OCT的缺点： 分辨率低于双光子荧光或共聚焦显微镜。 5.9 光学相干层析成
