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1、专题2 :微生物的培养与应用 微生物包括哪五类： 病毒病毒 细菌细菌 放线菌放线菌 真菌 原生动物 原核生物界 原生生物界 真菌界 病毒界 1、培养基可以分为哪两类？ 2、培养基一般都含有哪些营养物质，此外 还要满足哪些要求？ 3、获得纯净培养物的关键是什么？ 4、避免杂菌污染的方法主要包括哪四个方面 5、什么是消毒、灭菌，常用方法有哪些？ 6、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的方法步骤 7、如何倒平板？ （1）按物理状态来分：培养基可分为固体 培养基和液体培养基。其中固体培养基用 于菌种分离、鉴定菌落等。 （2）按功能来分，可分为选择培养基和鉴 别培养基。 （3）按成分来分，可分为天然培养基和合
2、成培养基。 培养基分类： 选择培养基 加入青霉素的培养基: 分离酵母菌、霉菌等真菌 加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌 不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基: 分离自养型微生物 加入青霉素等抗生素的培养基: 分离导入了目的基因的受体细胞 不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、 和氮源、 无机盐等营养物质，另外还需要 满足微生物生长对pH、特殊营养物质,例 如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能 合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌 呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等 的要求。 培养基的营养物质 2、培养基一般都含有哪些营养物质，此外 还要满足哪些要求？
3、 3、获得纯净培养物的关键是什么？ 4、避免杂菌污染的方法主要包括哪四个方面 5、什么是消毒、灭菌，常用方法有哪些？ 消毒与灭菌 消毒：指使用较为温和的物理或化学方法 仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害 的微生物（不包括芽孢和孢子）。 灭菌：指使用强烈的理化因素杀死物体内 外所有微生物，包括芽孢和孢子。 灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普 通也是最重要的技术。 消毒的方法： 1、煮沸消毒法:100煮沸5-6min 2、巴氏消毒法：70-75 下煮30min或 80 下煮15min 3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔 灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源 4、紫外线或化学药物消毒 灭菌的方法
4、： 1、灼烧灭菌 2、干热灭菌：160-170 下加热1-2h。 3、高压蒸汽灭菌：100kPa、 121 下维持15-30min. 6、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的方法步骤 7、如何倒平板？ 1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时 ，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基 的温度？ 答：可以用手触摸盛有培养基的锥形 瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手 时，就可以进行倒平板了。 2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微 生物污染培养基。 3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅 在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来
5、 培养微生物吗？为什么？ 答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固 后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置， 既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以 防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之 间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板 培养微生物。 纯化大肠杆菌 接种方法有： 平板划线法和稀释涂布平板法 平板划线法:通过接种环在琼脂固体培 养基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐 步稀释分散到培养基的表面. 在数次画线后,可以分离到由一个细胞 繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是 菌落. 微生物的恒温培养微生物的恒温培养 1.为什么在操作的第一步以及每次划
6、线之前 都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需 要灼烧接种环吗？为什么？ 答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接 种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线 前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种 环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的 菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线 次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少 ，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及 时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境 和感染操作者。 2.在灼烧接种环之后，为什么要等其 冷却后再进行划线？ 答：以免接种环温度太高，杀死菌种。 3.在作第二次以及其后的划线操作时， 为什么总是从上一次划线的末端开
7、始划线？ 答：划线后，线条末端细菌的数目比线 条起始处要少，每次从上一次划线的末端开 始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而 逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来 的菌落。 涂布平板的所有操作都应在火焰附近 进行。结合平板划线与系列稀释的无菌 操作要求，想一想，第2步应如何进行无 菌操作？ 应从操作的各个细节保证“无菌”。 例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、 吸管头不要接触任何其他物体、吸管要 在酒精灯火焰周围等等。 菌种的保存菌种的保存 1、临时保藏： 接种到固体斜面培 养基，菌落长成后 置于4冰箱保存。 2、长期保存： 甘油冷冻管藏法 课题课题2 2 土壤中分解尿素的细菌的土壤中分解尿素
8、的细菌的 分离与计数分离与计数 一、课题背景一、课题背景 1 1、尿素的利用、尿素的利用 尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接 被农作物被农作物吸收。吸收。土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成氨分解成氨之之 后才能被植物利用。后才能被植物利用。 2 2、细菌利用尿素的原因、细菌利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶 CO(NHCO(NH 2 2) ) 脲酶脲酶 + CO+ CO 2 2 NHNH 3 3 + H+ H 2 2O O 4 4、课题目的、课题目的 从土壤中分离出能够分解尿素的细菌
9、从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 统计每克土壤样品中究竟含有多少这样统计每克土壤样品中究竟含有多少这样 的细菌的细菌 一一. .研究思路研究思路 . .筛选菌株筛选菌株 . .统计菌落数目统计菌落数目 . .设置对照设置对照 1 1、实例：、实例： 启示：启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的寻找目的菌种时要根据它对生存环境的 要求，到相应的环境中去寻找。要求，到相应的环境中去寻找。 原因：因为热泉温度原因：因为热泉温度70708080 0 0 C C，淘汰了绝大多，淘汰了绝大多 数微生物只有数微生物只有TaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。 DNADNA多聚酶链式反应多聚酶链式反应是
10、是 一种在体外将一种在体外将少量少量DNADNA 大量复制大量复制的技术，此项的技术，此项 技术要求使用技术要求使用耐高温（耐高温（ 9393 0 0 C C）的）的DNADNA聚合酶。聚合酶。 . .筛选菌株筛选菌株 2 2、实验室中微生物的筛选原理：、实验室中微生物的筛选原理： 人为提供人为提供有利于目的菌株生长有利于目的菌株生长的条件的条件( (包括营包括营 养、温度、养、温度、pHpH等等) )，同时，同时抑制或阻止其他微生抑制或阻止其他微生 物物生长。生长。 什么是选择性培养基？什么是选择性培养基？ 15.0g15.0g琼脂琼脂 1.0g1.0g尿素尿素 10.0g10.0g葡萄糖葡
11、萄糖 0.2g0.2gMgSOMgSO4 47H 7H 2 2 OO 2.1g2.1gNaHNaH 2 2 POPO 4 4 1.4g1.4gKHKH 2 2 POPO 4 4 3 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培 养基：养基： 从物理性质看此培养基属于哪类？从物理性质看此培养基属于哪类？ 固体培养基固体培养基 在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？ 碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 氮源：氮源：尿素尿素 培养基的培养基的氮源为尿素氮源为尿素，只有能合成，只有能合成脲酶脲酶的微的微 生物才能分解尿素，以尿素作为氮源
12、。生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏缺乏 脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源 而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用 此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。 5 5、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选择分解尿素的微生物的原理 6 6、怎样证明此培养基具有选择性呢？、怎样证明此培养基具有选择性呢？ 以尿素为 唯一氮源 的培养基 牛肉膏 蛋白胨 培养基 是 分离 尿素 细菌 判断该 培养基 有无选 择性 实验组 对照组 培养基类型 是否 接种 目的 结果 只生长尿 素细
13、菌 生长多种 微生物 是 6 6、怎样证明此培养基具有选择性呢？、怎样证明此培养基具有选择性呢？ 以尿素为 唯一氮源 的培养基 牛肉膏 蛋白胨 培养基 是 分离 尿素 细菌 判断该 培养基 有无选 择性 实验组 对照组 培养基类型 是否 接种 目的 结果 只生长尿 素细菌 生长多种 微生物 是 1 1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数： 利用利用血球计数板血球计数板，在显微镜下计算一定容积里，在显微镜下计算一定容积里 样品中微生物的数量。样品中微生物的数量。 . .统计菌落数目：统计菌落数目： 不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数； 需要相对
14、高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察； 缺点缺点 2.2.间接计数法（间接计数法（活菌计数法）活菌计数法） 原理：原理：在稀释度足够高时，微生物在固在稀释度足够高时，微生物在固 体培养基上所形成的体培养基上所形成的一个菌落一个菌落是由是由一个单一个单 细胞细胞繁殖而成的，即繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个菌落代表原先的 一个单细胞。一个单细胞。 常用方法：稀释涂布平板法。常用方法：稀释涂布平板法。 每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(CV)M(CV)M 其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平代表某一稀释度下平板上生
15、长的平 均菌落数，均菌落数，V V代表涂布平板时所用的稀释液代表涂布平板时所用的稀释液 的体积的体积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。 注意事项注意事项 为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在 3030300300的平板上进行计数。的平板上进行计数。 为使结果接近真实值可将同一稀释度加为使结果接近真实值可将同一稀释度加 到到三个或三个以上三个或三个以上的平皿中，经涂布，培的平皿中，经涂布，培 养计算出菌落养计算出菌落平均数平均数。 统计的菌落往往比活菌的统计的菌落往往比活菌的实际数目低实际数目低。 设置对照的主要目的是排除实验组中设置对照的主要目
16、的是排除实验组中非测试非测试 因素对实验结果的影响，提高实验结果的可因素对实验结果的影响，提高实验结果的可 信度。信度。 . .设置对照：设置对照： 实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌 落数目的实验时，落数目的实验时，A A同学从对应的同学从对应的1010 6 6 倍稀释的培养基中筛选出大约 倍稀释的培养基中筛选出大约150150个菌个菌 落，但是其他同学在同样的稀释度下落，但是其他同学在同样的稀释度下 只选择出大约只选择出大约5050个菌落。分析其原因。个菌落。分析其原因。 原因：原因：土样不同，土样不同， 培养基污染或操作失误培养基污染或操作失误 ( (或者是混入了其他的含氮物质或者是混入了其他的含氮物质) ) 小结：小结：通过这个事例可以看出，实验结果通过这个事例可以看出，实验结果 要有说服力，对照的设置是必不可少的。要有说服力，对照的设置是必不可少的。 方案一：方案一
