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1、在用 SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量时，应注意以下几个问题：1如果蛋白质-SDS 复合物不能达到 1.4 克 SDS/1 克蛋白质的比率并具有相同的构象，就不能得到准确的结果。影响蛋白质和 SDS 结合的因素主要有以下 3 个：（1）二硫键是否完全被还原：只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下，SDS 才能定量地结合到蛋白质分子上去，并使之具有相同的构象。一般以巯基乙醇作还原剂。在有些情况下，还需进一步将形成的巯基烷基化，以免在电泳过程中重新氧化而形成蛋白质聚合体。 （2）溶液中 SDS 的浓度：溶液中的 SDS 的总量，至少要比蛋白质的量高 3 倍，一般需高达 10 倍以上。 （3
2、）溶液的离子强度：溶液的离子强度应较低，最高不能超过 0.26，因为 SDS 在水溶液中是以单体和分子团的混合体而存在的，SDS 结合到蛋白质分子上的量，仅决定于平衡时 SDS 单体的浓度而不是总浓度，在低离子强度的溶液中，SDS 单体具有较高的平衡浓度。 2不同的凝胶浓度适用地不同的分子量范围，Weber 的实验指出，在 5%的凝胶中，分子量 25,000200,000 的蛋白质，其分子量的对数与迁移率呈直线关系；在 10%的凝胶中，10.00070,000 分子量的蛋白质呈直线关系；在 15%的凝胶中，10,00050,000 分子量的蛋白质呈直线关系；3.33%（以上各种浓度的凝胶，其交
3、联度都是 2.6%）的凝胶可用于分子量更高的蛋白质。 可根据所测分子量范围选择最适凝胶浓度，并尽量选择分子量范围和性质与待测样品相近的蛋白质作标准蛋白质。标准蛋白质的相对迁移率（蛋白质的电泳迁移距离除以染料迁移距离即为相对迁移率，详见后）最好在 0.20.8 之间均匀分布。 在凝胶电泳中，影响迁移率的因素较多，而在制胶和电泳过程中，很难每次都将各项条件控制得完全一致，因此，用 SDS-凝胶电泳法测定分子量，每次测定样品必须同时做标准曲线，而不得利用另一次电泳的标准曲线。 3有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如 -胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在 SDS 和巯基乙醇的作用下，解离成
4、亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，与 SDS-凝胶电泳的结果互相参照。 2试剂：（1）标准蛋白质目前国内外均有厂商生产低分子量及高分子量标准蛋白质成套试剂盒，用于 SDS-PAGE 测定未知蛋白质分子量。低分子量标准蛋白试剂盒，中国科学院上海生物化学研究所东风生化试剂厂生产（表16-2） 。表 16-2 5 种标准蛋白质蛋白质名称 Mr磷酸化酶 B牛血清蛋白肌动蛋白磷酸酐酶烟草花叶病毒外壳蛋白 94 00067 00043 00030 0
5、0017 500每种蛋白含量为 40g。用时加入 200l 样品溶解，经处理后，上样 10l（2g）就能显示出清晰的条带。 自己配制低分子量或高分子量标准蛋白质混合试剂。如买不到标准蛋白试剂盒时，可参考常用的标准蛋白质及其分子量表。从中选择 35 种蛋白质，如马心细胞色素 C（Mr12 500） 、牛胰胰凝乳蛋白原 A（ Mr25 000） 、猪胃胃蛋白酶（Mr35 000） 、鸡卵卵清蛋白（Mr43 000） 、牛血清白蛋白（Mr67 000）等蛋白质，按照每种蛋白 0.51mgml-1 样品溶解液配制。可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。（2）不连续体系 SDS-PAGE
6、有关试剂 10%（W/V）SDS 溶液：称 5gSDS，加重蒸水至 50ml，微热使其溶解，置试剂瓶中，4贮存。SDS 在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。 1%TEMED（V/V）：取 1mLTEMED，加重蒸水至 100ml，置棕色瓶中，4贮存。 10%AP（W/V ）：称 AP1g，加重蒸水至 10ml。最好临用前配制。 样品溶解液：内含 1%SDS，1%巯基乙醇，40% 蔗糖或 20%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01molL-1 pH8.0 Tris-HCl 缓冲液。 先配制 0.05molL-1 pH8.0 Tris-HCl 缓冲液：称 Tris 0.6g，加入 50ml 重蒸
7、水，再中入约3ml 1molL-1 HCl，调 pH 至 8.0，最后用重蒸水定容至 100ml。 按表 16-4 配制样品溶解液。 表 16-4 不连续体系样品溶解液配制SDS 巯基乙醇 溴酚蓝 蔗糖 0.05molL-1Tris-HCl 加重蒸水至最后总体积为100mg 0.1ml 2mg 4g 2ml 10ml*如样品为液体，则应用浓一倍的样品溶解液，然后等体积混合。 凝胶贮液 30%分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称 Acr 30g 及 Bis 0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至 100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4贮存。 10%浓缩胶贮液：称 Acr 10g 及 Bis 0.5g
8、，溶于重蒸水中，最后定容至 100mL，过滤后置棕色试剂瓶中，4贮存。 凝胶缓冲液 分离胶缓冲液（3.0molL-1 pH8.9 Tris-HCl 缓冲液）：称 Tris 36.3g，加少许重蒸水使其溶解，再加 1molL-1 HCl 约 48ml，调 pH 至 8.9，最后加重蒸水定容至 100ml，4贮存。 浓缩胶缓冲液（0.5molL-1 pH6.7 Tris-HCl 缓冲液）：称 Tris6.0g，加少许重蒸水使其溶解，再加 1molL-1 HCl 约 48ml 调 pH 至 6.7。最后用重蒸水定容至 100ml，4贮存。 电极缓冲液（内含 0.1%SDS，0.05molL-1 Tr
9、is0.384 molL-1 甘氨酸缓冲液 pH8.3）：称 Tris6.0，甘氨酸 28.8g，加入 SDS 1g，加蒸馏水使其溶解后定容至 1000ml。 1%琼脂（糖）溶液：称琼脂（糖）1g，加电极缓冲液 100ml，加热使其溶解，4贮存，备用。（4）固定液取 50%甲醇 454ml，冰乙酸 46ml 混匀。（5）染色液称考马斯亮蓝 R250 0.125g，加上述固定液 250ml，过滤后应用。（6）脱色液冰乙酸 75ml，甲醇 50ml，加蒸馏水定容至 1000ml。四、操作步骤：（一）安装夹心式垂直板电泳槽关心式垂直板电泳槽操作简单，不易渗漏，其装置如图 16-4。这种电泳槽两侧为有
10、机玻璃制成的电极槽，两个电极槽中间夹有一个凝胶模，该模由 1 个 形硅胶框、长与短玻璃板及样品槽模板（梳子）所组成（见图 16-5） 。电泳槽由上贮槽（白金电极在上或面对短玻璃板） ，下贮槽（白金电极在下或面对长玻璃板）和回纹状冷凝管组成。两个电极槽与凝胶模间靠贮液槽螺丝固定。各部间依下列顺序组装：2、将长、短玻璃板分别插到 形硅橡框的凹形槽中。注意勿用手接触灌胶面的玻璃。 3、将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。 4、将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。 5、竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的 1%琼脂（糖
11、） 。其目的是封住空隙，凝固后的琼脂（糖）中应避免有气泡。 （二）配胶及凝胶板的制备 1配胶 根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。由于 SDS-PAGE 有连续系统及不连续系统两种，两者间有不同的缓冲系统，因而有不同的配制方法，见表 16-5 和表 16-6。 表 16-5 SDS-不连续体系凝胶配制电极缓冲液为 pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液，内含 0.1%SDS。电极缓冲液为 0.1molL-1 pH7.2 磷酸缓冲液，内含 0.1%SDS。 2凝胶板的制备 （1）SDS- 不连续体系凝胶板的制备 分离胶的制备：按表 16-5 配制 20ml10%分离胶，混匀后用细长头滴管将
12、凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约 8cm 高，用 1ml 注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约 34mm 高，以进行水封。约 30min 后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。 浓缩胶的制备：按表 16-5 配制 10ml3%浓缩胶，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约 0.5cm 处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，约 30min 后凝胶聚合，再放置 2030min，使凝胶“老化”。小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将 pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液倒入
13、上、下贮槽中，应没过短板约 0.5cm 以上，即可准备加样。 （三）样品的处理与加样1样品的处理根据分子量标准蛋白试剂盒的要求加样品溶解液，如上海东风生化试剂厂生产的低分子量标准蛋白试剂盒，每一安瓿则需加入 200L 样品溶解液，自己配制标准及未知样品，按.51mg/1mL 样品溶解液，溶解后，将其转移到带塞小离心管中，轻轻盖上盖子（不要塞紧以免加热迸出） ，在 100沸水浴中保温 3min，取出冷却后加样。如处理好的样品暂时不用，可入在20冰箱保存较长时间，使用前在 100沸水中加热 3min，以除去亚稳态聚合。2、加样一般每个凹形样品槽内，只加一个种样品或已知分子量的混合标准蛋白质，加样体
14、积要根据凝胶厚及样品浓度灵活掌握，一般加样体积为 1015L（即 210g 蛋白） 。如样品较稀，加样体积可达 100L。如样品槽中有所泡，可用注射器针头挑除。加样时，将微量注射器的针头通过电极缓冲液伸入加样槽内，尽量接近底部，轻轻推动微量注射器，注意针头勿碰破凹形槽胶面。由于样品溶解液中含有比重较大的蔗糖或甘油，因此样品溶液会自动沉降在凝胶表面形成样品层。（四）电泳分离脉聚合后是否进行预电泳则应根据需要而定，SDS 连续系统预电泳采用 30mA60120min。1不连续系统在电极槽中倒入 pH8.3Tris-HCl 电级缓冲液，内含 0.1%SDS 即可进行电泳。在制备浓缩胶后，不能进行预电
15、泳，因预电泳会破坏 pH 环境，如需要电泳只能在分离胶聚合后，并用分离胶缓冲液进行。预电泳后将分离胶面冲洗干净，然后才能制备浓缩胶。电泳条件也不同于连续 SDS-PAGE。开始时电流为 10mA 左右，待样品进入分离胶后，改为 2030mA，当染料前沿距硅橡胶框底边 1.5cm 时，停止电泳，关闭电源。（五）凝胶板剥离与固定电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅橡胶框，用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板，在凝胶板切下一角作为加样标志，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。将凝胶板放在大培养皿内，加入固定液，固定守液。（六）染色与脱色将染色液倒入培养皿中，染色 1h 左右，用蒸馏水漂洗数次，再用
16、脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。（七）结果与分析1绘制标准曲线将大培养皿放在一张坐标纸上，量出加样端距细铜丝间的距离（cm）以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离（cm） ，如图 18-6 所示。按下式计算相对迁移率 mR：以标准蛋白质的相对迁移率为横坐标，标准蛋白质分子量为纵坐标在半对数坐标纸上作图，可得到一条标准曲线。 2根据未知蛋白质样品相对迁移率直接在标准曲线上查出其分子量。 3分析各蛋白质相对迁移率高氏主要是由什么决定的？ 注意事项 （1）由于与凝胶聚合有关的硅橡胶称、玻璃板表面不光滑洁净，在电泳时会造成凝胶板与玻璃板或硅橡胶条剥离，产生气泡或滑胶；剥胶时凝胶板易断裂，为防止引现象，所用器材均应严
