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1、 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 第27卷 第3期 中 国 乳 品 工 业Vol127 ,No13 1 9 9 9年 6月 CHINA DAIRY INDUSTRYJune 1 9 9 9 乳酸菌增菌培养基的优化设计 The Design of Orthogonality Test Optimizing of Enrichment Medium of Lactic Acid Bacteria 吕加平 Lu Jiaping 梁占东 Liang Zhandong (
2、东北农业大学 哈尔滨150030) (黑龙江省粮油食品贸易公司) (Northeast Agricultural University) (Heilongjiang Provincial Grain and Oil Trade Co. ) 骆承庠 Luo Chengxiang 郭彦友 Guo Yanyou (东北农业大学 哈尔滨150030) (黑龙江味全乳品公司 安达151401) (Northeast Agricultural University) (Heilongjiang Wei Quan Dairy Company) 摘 要:采用有交互作用正交试验优化设计了乳酸 菌(嗜热链球菌和保
3、加利亚乳杆菌)增菌液,结果表 明,对嗜热链球菌宜采用酪蛋白水解物、 乳糖、 番茄 汁、-磷酸甘油二钠,而保加利亚乳杆菌则宜采用 鱼肉蛋白胨、 乳糖、 酵母浸膏、K2HPO4- KH2PO4,在 37 下培养24 h后菌落总数分别可达5. 76109 cfu/ ml和4. 69108cfu/ ml。 关键词:乳酸菌;增菌液;正交试验 Abstract: The orthogonality test used to design the opti2 mum enrichment broth of lactic acid bacteria (streptococ2 cus thermophilus
4、( ST - 1)and lactobacilus bulgaricus (LB - 1) ) . The best enrichment broth for ST - 1 consist of casein hydrolysate lactose、tomato juice ,-glyc2 erophosphate disodium ,and the optimum enrichment broth for LB - 1 consist of peptone (fish powder)、lactose、K2 HPO4- KH2PO4、yeast extract. Two enrichment
5、medium inoculated with ST- 1 and LB - 1 cultivated at 3724 h , and the viable counts were 5.76109cfu/ ml and 4.69 108cfu/ ml ,respectively. K ey words: orthogonality test ; enrichment medium;lac2 tic acid bacteria 收稿日期 19990318 吕加平 男,35岁,教授,从事食品微生物学与乳品工艺学的教学与 科研工作. 0 引 言 乳酸菌分离培养及其酶学研究、 乳酸菌发酵剂 的制备等都需
6、要有良好的增菌培养基,使乳酸菌得 以大量增殖,从而使乳酸菌在经过喷雾干燥、 冷冻、 冻干等处理后有足够的活菌数残存。增菌培养基大 致分为配制培养基、 乳基质培养基和乳清基质培养 基,而后两者因其增殖慢,或不易分离菌体而不宜采 用,或常常又配合以其他生长因子方可使用。另外, 据培养基pH值的调控方式又可分为内外控型增菌 液;外控型因需要专用的自动控制发酵罐而受到限 制,而内控型则是将适宜的缓冲盐类加于培养基中 使用。本研究拟采用正交设计,选取了常用的碳源、 氮源以及缓冲盐类来优化设计保加利亚乳杆菌与嗜 热链球菌的增菌液配方,便于两菌的增殖及制备发 酵剂。 1 材料与方法 1. 1 材 料 氮源材
7、料:鱼肉蛋白胨,胰蛋白胨,酪蛋白水解 胨,牛肉浸膏,酵母粉,均为生化试剂级。 碳源材料:乳糖、 蔗糖、 葡萄糖为分析纯。 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 维生素、 核苷酸等营养素源:西红柿汁,酵母粉, 牛肉浸膏。 缓冲盐类: K2HPO4、KH2PO4、 柠檬酸三钠、 乙酸 钠、 -磷酸甘油二钠等均为分析纯试剂。 天然原料:乳清粉购于北京中牧集团,脱脂粉为 新西兰进口粉。 蛋白酶:胃蛋白酶。 753紫外-可见分光光度计:上海分析仪器厂 生产。 1. 2 方 法
8、1. 2. 1 试验设计 考虑到培养基碳源、 氮源及其他营养成分之间 可能存在联合协同的交互作用,因而,采用正交试验 法,具体因素水平项目设计如表1所示。 表1 正交试验设计的因素水平项目(配制200ml) 水平 因素A (1g) 因素B (2g) 因素C因素D 1鱼肉蛋白胨乳糖番茄汁(20ml) K2HPO4、KH2PO4 (各 0.5g) 2胰蛋白胨蔗糖牛肉浸膏(1g) -磷酸甘油二钠 (1g) 3酪蛋白水解物葡萄糖酵母浸膏(1g) 柠檬酸三钠、 乙酸钠 (各 0.5g) 考虑到D因素与其他3个因素间的差别大,因 此可将其与其他因素的交互作用忽略不计,而作为 误差项用以评价其他因素项的可靠
9、性。 菌体生长的测定:采用分光光度计于600 nm处 测定菌液的吸光度。 增菌液的配制:配制27种增菌液。培养液先经 加热煮沸以沉淀部分不溶蛋白,经滤纸过滤,使增菌 液呈完全澄清透明,以便于比色,增菌液经105 灭 菌15 min。 菌体培养:将活化三代的ST - 1与LB - 1两菌 (于M17和MRS分别活化 ) , 按1 %接种量接种于27 种增菌液中,以灭菌方法分装5瓶,于37 下培养, 24 h后测定OD值与pH值。 2 结果与讨论 2. 1 嗜热链球菌(ST- 1)增菌培养基的优化配方设 计 具体正交试验结果与方差分析见表2、 表3。 从表2与表3试验结果可以看出:A , B ,
10、C, D 四因素的交互作用不显著,而不同的因素水平,即不 同种类的碳、 氮及微量营养素源,对嗜热链球菌ST - 1增菌效果的影响极显著(除C因素外 ) ; 各因素 对ST- 1增菌效果的影响大小顺序依次为:BA DC; C因素对ST- 1增菌的影响不显著,那么试 验结果优化的最佳增菌培养基配方应为A3B1C1 D2,即酪蛋白水解物(0. 5 %) ,乳糖(1 %) ,番茄汁 (10 %) ,-磷酸甘油二钠(0. 5 %) ,pH值调节为 6.67. 0为宜。从正交试验表的结果来看,试验 9、20、21的吸光度值均呈较高水平。另外,按最佳 水平配制的增菌液在接种活化二代的ST - 1(0. 5
11、% 接种量 ) , 在培养24 h后,菌落总数可达5. 76109 cfu/ ml ,比M17和番茄汁增菌液(按同样方式接种ST - 1) 的增菌数均高,后两者的菌落总数为2. 4108 和3. 75108(测定结果均为平均值)。这一结果表 明,通过正交试验优选的配方是吸取了M17与番茄 汁培养基两者的优势影响因素组合而成。 表2 ST- 1与LB - 1增菌液正交试验 试验号ST- 1LB - 1试验号ST- 1LB - 1 10.3650.52150.1800.07 20.4100.57160.2000.07 30.3370.47170.2250.08 40.4200.34180.1250
12、.24 50.2100.03190.4300.28 60.2550.04200.4900.465 70.2050.19210.6000.25 80.1150.145220.2280.25 90.2400.345230.3950 100.3800.045240.3350.025 110.1900250.3750.35 120.1900.3260.1000.19 130.2150270.2480.45 140.1400.075 2.2 保加利亚乳杆菌(LB - 1)增菌培养基的优化配 方设计 具体正交试验方案与方差分析见表2和表4。 从表2和表4试验结果的统计分析数据可见: A , B , C,
13、D四因素之间的交互作用不显著,各因素 对LB - 1增菌效果影响大小顺序依次为BAD C,与前述ST- 1的相同;C因素对LB - 1增菌的 影响不显著,但在实际应用中,酵母浸出物与牛肉膏 对乳酸菌还是有显著的增菌效果,而本试验统计结 果出现不显著,可能在试验中A , B , C三因素之间 可能存在交互作用(因A , B作用显著,而掩蔽了 C因素的作用 ) , 因为按极差分析C因素的影响是 31 1999年6月 乳酸菌增菌培养基的优化设计 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reser
14、ved. 显著的,因此,在设计配方时不宜将C因素去掉;由 试验结果优化的最佳增菌培养基配方应为A1B1C3 D1,按此组合配制的增菌液接种活化两代的LB - 1 菌后的增菌效果尚可(菌落总数为4. 60108 ) , 但不 如ST- 1增菌液对ST- 1的增菌效果;与MRS和番 茄汁、 乳清培养基、 麦芽汁培养基、 酶解乳清培养基 的比较发现,最佳配方的增菌效果与MRS的增菌效 果相近,因此,在实验应用中,还应加入微量Mn与 Mg来促进其生长,实验结果也表明这一点。具体比 较试验见表5 ,试验的最佳配方与相关培养基相比 在配制方法、 原料价格方面还是有一定优势。应用 中可将缓冲盐、 微量盐Mg
15、SO4、MnSO4配制成盐贮备 溶液,用时按量加入盐溶液即可,缩短了配制 时间。 表3 方差分析() 方差来源变差平方和自由度方差估计值F值F0.05 (f 1,f2)显著性最佳水平 A0.102 2382 0.051 11922.861 85.143 3A3 B0.139 1012 0.069 55131.105 15.143 3B1 C0.016 4802 0.008 243.685 25.14 C1 D0.079 8962 0.039 94817.865 85.143 3D2 AB0.034 5774 0.008 6443.865 85.14 AC0.018 4784 0.004 619
16、 52.065 95.14 BC0.006 5764 0.001 6440.735 25.14 试验误差0.013 4176 0.002 236 总和0.410 76326 表4 方差分析() 3,4 方差来源变差平方和自由度方差估计值F值F0.05 (f 1,f2)显著性最佳水平 A 0.192 1972 0.096 098 513.7455.143 3A1 B 0.240 8672 0.120 433 517.2255.143 3B1 C 0.024 602 0.012 31.759 25.14 C3 D 0.095 2392 0.047 619 56.810 765.143D1 AB 0.125 9644 0.031 4914.503 995.14 AC 0.050 5544 0.012 638 51.807 625.14 BC 0.099 0744 0.024 768 53.542 55.14 试验误差 0.041 9516 0.006
