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1、第八章 转录产物的加工 在细胞内，由RNA聚合酶合成的原初转录物 （primary transcript）往往需要一系列的变化，包 括链的裂解、5和3末端的切除和特殊结构的形成 、核苷的修饰、以及拼接和编辑等过程，才转变 为成熟的RNA分子。此过程总称为RNA的成熟或 称为RNA的转录后加工。 tRNA前体的转录后加工 rRNA前体的转录后加工 一、RNA 转录后的加工与修饰概述 原核生物的mRNA转录后一般不需要加工，转 录的同时即进行翻译（半寿期短）。 真核生物转录和翻译在时间和空间上是分开的 ，刚转录出来的mRNA是分子很大的前体hnRNA (heterogeneous nuclear
2、RNA，核内不均一RNA)。 hnRNA分子中大约只有10%的部分转变成成熟的 mRNA，其余部分将在转录后的加工过程中被降 解掉。 二、原核生物RNA的转录后加工 1. 原核生物tRNA前体的加工 原核的tRNA初始转录本多为多顺反子（ polycistron）少数的tRNA前体为单顺反子（ monocistron）如tRNAser 串联的tRNA分子都是相同的，如tRNATyr- tRNATyr； 串联的tRNA分子是不同的，如tRNAIle- tRNAAla-tRNAThr； 由tRNA和rRNA串联组成。 (1) tRNA3-端的成熟 此过程由多种内切酶和外切酶的共同参与。 内切酶 R
3、Nase P 识别发夹结构并粗切割3， 5端额外序列； 内切酶 RNase F识别发夹结构并进一步切割3 端冗余序列； 对于具有CCA末端的I型tRNA前体修整3端的 外切酶是RNase D，在CCA末端它一次切除（或逐 步切除）3的碱基。 对于没有CCA序列的II型tRNA前体分子，在 切除3-端附加序列后，在tRNA核苷酸转 移酶(tRNA nucleotidyl transferase）的 作用下，逐个添加上去的。 tRNA+CTP tRNA-C+PPi tRNA-C+CTP tRNA-CC+PPi tRNA-CC+ATP tRNA-CCA+PPi (2) tRNA5-端的成熟 RNas
4、eP是一种不常用的酶，是由蛋白和RNA组 成的复合体。其RNA长375nt，分子量为130kDa。 RNase P具有内切酶的活性，可切除E.coli前体 tRNA 5端的前导序列（41nt） 此酶不识别特殊的序列，而识别二级结构 发夹所组成的tRNA。即：S.Altman提出的外部引 导理论。类核糖核酸酶P-外部引导序列技术 在前体tRNA的一些专一部位的碱基需要通过 甲基化酶，硫醇酶，假尿嘧啶核苷化酶等的作 用进行修饰成为特殊的碱基，如氨基酸臂上 5的4-硫尿苷（4tu），D臂上的2甲基鸟苷（ 2mG），TC臂上的假尿苷（）以及反密码 子环上的2异戊腺苷（2ipA） (3) 核苷酸的修饰
5、表示核酸内切酶的作用 表示核苷酸转移酶的作用 表示核酸外切酶的作用 表示异构化酶的作用 a、切除tRNA前体两端多余的序列： 5端切除几到10个核苷酸。 b、末端添加：3-端添加CCA序列。 c、修饰：形成稀有碱基如DH2 。 RNAaseP RNAaseFRNAaseP RNAaseF RNAaseD RNAaseD A C C tRNA前体分子的加工 2. 原核rRNA加工 原核生物有rrnA-rrnG共7个rRNA转录单位分散 在基因组中，每个 转录单位由16SrRNA、 23SrRNA 、 5SrRNA 及tRNA组成； rRNA含非转 录的间隔区，其产物中含tRNA。rRNA基因之间
6、 以纵向串联的方式重复排列。 加工过程： 1）甲基化修饰：修饰在碱基和2-核糖上。 2）剪切作用：需核酸酶（RNase III)参与 （RNAIII） RNase III RNase III是一种负责RNA加工的内切核酸酶，可特 异识别特定的RNA双螺旋区，在茎部错位两个2bp的 位点切割，因此每个片段的3端都有2个碱基突出 。 Dicer 酶是RNase III家族中特异识别双链RNA的一 员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导 入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链 RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链 RNAs(siRNAs)，在RNA干扰（RNA interfe
7、rence)中 具有重要作用. 3. 原核生物mRNA前体的加工 原核生物没有细胞核，不存在时空间隔，一般不需 要加工，一经转录即可翻译，一个多顺反子上可被 翻译出多个蛋白分子。 原核生物中少数多顺反子mRNA需要通过核酸内切 酶（RNase III）切成较小的单位后再进行翻译。 三. 真核生物tRNA前体的转录后加工 真核tRNA的基因和原核不同： 真核的前体分子tRNA是单顺反子，但 成簇排列，基因间有间隔区。如在爪蟾中 每个基因组中各个tRNA基因超过200拷 贝，是一种重复序列； 真核tRNA基因一般都比原核tRNA基因 多得多，如酵母约有400个tRNA基因； tRNA的前体分子中含
8、有内含子，其特点是： A.位置相同，都在反密码子环的下游； B.不同tRNA的内含子长度和序列各异； C.外显子和内含子交界处无保守序列，故其内 含子的剪切是依靠RNase异体催化进行剪切； D.内含子和反密码子配对形成茎环，改变了反 密码子臂的结构，保护了反密码子，使其免受某 些酶的降解。 酵母tRNAPhe内含子的结构（引自B.Lewn: ,2000） 真核tRNA的加工和原核有区别，包括： 剪接内含子的过程； 3端都要加CCA； 核苷酸修饰 1）内含子的剪接 (1) 内含子的切除 tRNA内切酶切割前体分子中的内含子； 酵母tRNA在未处理前先进行 凝胶电泳，结果只显示一条 带，且跑得较
9、慢，表明此 tRNA的前体分子；当加入核 酸内切酶后无需加入ATP， 反应后再走电泳，结果出现 二条带，一条是剪切后游离 出的内含子，另一条是互补 的外显子，称为tRNA的半分 子（tRNA half-molecules ）。 (2) 内含子切除及外显子连接 切除tRNA内含子的核酸酶很特殊，不是形成3 -OH和5-P，而是产生了2-3环磷酸和5-OH ，因此不能直接连接； 通过环磷酸二酯酶（phosphodiesterase）将2 -3环磷酸打开，形成3-OH，2-P； 5端须在激酶作用下将5-OH磷酸化； 通过连接酶将两个半分子连接起来。 注意： 真核tRNA内含子的精确剪切不依赖内含子的
10、序 列和大小，内含子的突变并不影响剪切。原则上 是依赖对tRNA共同的二级结构的识别，而不是内 含子的保守序列。分子不同部分的区域对于剪切 是重要的，包括受体臂，D环，TC环和反密码子 环。 内含子环中的一个碱基与茎上的一个碱基进行配 对这对剪切来说是重要的。影响此配对的其他位 点的突变也会影响剪接。 （3） 3端添加-CCA 真核生物中所有tRNA前体分子都是II型 分子，3端缺乏-CCAOH结构，必须在 tRNA核苷酸转移酶 (tRNA nucleotide transferase) 催化下进行3端的添加，由 CTP和ATP提供胞苷酸和腺苷酸 （4） 核苷酸的修饰 （1） tRNA甲基化酶
11、 （2）tRNA异戊烯转移酶 （3）tRNA-鸟嘌呤转糖苷酶 （4）tRNA硫转移酶 四. 真核生物rRNA前体的转录后加工 1）真核rRNA前体基因特点 转录区与非转录区交替，在核仁区成簇排列 不同生物的rRNA前体大小不同，多数真核生物的 18S，5.8S和28S rRNA基因是串联在一起形成一个转 录本，初始转录本为45S前体，5S rRNA是和它们分 开转录的； 前体rRNA与蛋白质结合，在核仁中进行剪切； 大多数没有内含子 （四膜虫除外） 2）rRNA前体的核苷酸修饰加工的snoRNA snoRNA(small nucleolar RNA，核仁小分子 RNA)是细胞核内一类高丰度的小
12、分子非编码RNA. 近10年来,采用RNA组学方法,已从多种模式生物 中鉴定出200多种snoRNA.研究结果表明:snoRNA长 约87-275bp,与细胞内特定核糖核蛋白体结合，生 成核仁小分子核糖核蛋白体（snoRNP） snoRNP是一类新型调控分子，参与rRNA前体加 工与折叠,并具有指导rRNA,tRNA和snRNA转录后核 苷修饰功能. （1）snoRNA的结构 根据结构元件，目前已知的snoRNA 可以划分为3 大 类：box C/D snoRNA、box H/ACA snoRNA 和 MRP RNA。 MRP RNA是极为特殊的snoRNA，在数量和功能上 都迥异于其他sno
13、RNA。 MRP RNA 只有一种分子存 在于细胞中，并与九种蛋白质结合形成MRP RNA 复 合物，参与5.8S rRNA 的加工和线粒体DNA 的复制 ；另外，作为RNase P 的RNA 成分，它参与了 tRNA 的5 端成熟过程。 细胞中主要的snoRNA 是box C/D snoRNA 和box H/ACA snoRNA。 box C/D snoRNA 包含有两个短的序列元件，即位于5 末端的 box C(RUGAUGA)和3 末端的box D(CUGA)。多数box C/ D snoRNA基因的5 和3 末端都有4 5 nt 的反向重复序列，可 以形成较为稳定的短茎结构，这一结构在
14、snoRNA 的生物合成 和核仁定位过程中起关键作用。最为常见的是指导rRNA 特定 位点的2-O- 甲基化修饰。 (2) box C/D snoRNA指导rRNA 甲基化修饰 box H/ACA snoRNA 具有保守的“发夹- 铰链- 发夹- 尾”的二级结构。 box H (ANANNA，N 代表任一核苷酸)位于单链形式的铰链区，ACA 则 一般位于3 末端上游3 个核苷酸处。 box H 和box ACA 不仅是snoRNA 正确行使功能必需的结构，而且与snoRNA 在细胞中具备完整的分子末 端并稳定存在密切相关。此外，假尿嘧啶化泡两翼的短茎结构也是 snoRNA 正确行使功能所必需的
15、。 （3）box H/ACA snoRNA 参与rRNA前体假尿苷酸的生成 真核生物rRNA的甲基化程度比原核甲基化程度高 。且大多数在核糖部分的2-羟基上； 与原核生物类似，真核生物rRNA前体也是先甲基 化后切割； 真核生物rRNA前体的甲基化、假尿苷酸化和切割 在核仁小RNA,snoRNA指导下进行。 3）真核生物rRNA前体的剪切 5个阶段，速率相对较慢 (1)在snoRNA指导下对45S的rRNA前体进行修饰； (2)切除5端的前导序列，即外部的转录间隔序列 （ETS），使45S的初始转录本变成41S的中间产 物； (3) 从41S的中间产物切成两段，产物分别为20S（ 含18S r
16、RNA片段）和32S； (4) 通过剪切和修剪，将32S片段加工成5.8S和28S rRNA；将20S片段加工成18S rRNA （5）5.8S和28S rRNA之间的部分序列相互配对， 形成核糖体大亚基的rRNA复合物。 5.8S28S 人Hela 细胞rRNA前体转录后加工示意图 5.8S 28S 45S 41S 5.8S28S 20S 32S 5.8S 28S Pre-rRNA 18S 18S 18S 18S 18S 4) 含内含子的rRNA的加工 mRNA的前体为核内不均一RNA（heterogenous nuclear RNA, hnRNA）。平均分子长度为8- 10Kb(2Kb-14Kb)左右。比mRNA的平均长 度（1.8 -2Kb）要大4-5倍 hnRNA仅有总量的1
