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1、华中科技大学 博士学位论文 中华抱茎蓼次生代谢产物及其生物活性研究 姓名：向梅先 申请学位级别：博士 专业：生物制药工程 指导教师：闫云君 2011 I 华华 中 科中 科 技技 大 学 博 士 学 位 论大 学 博 士 学 位 论 文文 摘摘 要要 中药中华抱茎蓼 (俗称血三七)为蓼科蓼属中华抱茎蓼 (Polygonum amplexicaule D. Don var.sinense Forbes et Hemsl.) 的干燥根茎，是湖北省恩施地区少数民族民间 常用药材，具有清热解毒，活血化瘀的作用，用于治疗许多疾病，如促进血液循环， 治疗各种骨折等，在当地被称为跌打损伤的“要药”。现临床证
2、实其还能抗真菌、治 疗脑动脉粥样硬化及妇女痛经等疾病。除药效确切外，血三七资源分布也很广泛： 既有大量野生的，也有大量家种的。但到目前为止，人们对其研究仍然比较零星， 尚缺乏系统性，阻碍了血三七的广泛应用。为此，本研究对血三七次生代谢产物进 行了提取分离、结构鉴定和生物活性筛选，并对不同产地的血三七进行定性和定量 指纹图谱分析研究，为制定该药材完善的质量标准提供了科学依据。在此基础上， 利用现代药理学手段对血三七抗真菌活性、促骨折愈合作用机理及镇痛等不同药效 进行了验证研究，为将来开发新药提供科学依据。本研究的主要工作及创新点如下： （1）采用各种色谱技术，包括薄层色谱、正相硅胶柱、反向硅胶柱
3、、葡聚糖 凝胶柱、半制备高效液相柱，对血三七乙酸乙酯部位的化学成分进行了系统分离研 究，获得40余个单体化合物；运用现代波谱技术 （如 UV、IR、 1H-NMR、13C-NMR、 DEPT、EI-MS）分析其结构，最终鉴定了23个化合物，其中20个化合物系首次从该 植物中分离得到，更有5个是首次从蓼属中分离获得，且多数为黄酮类和蒽醌类化 合物，具有较强药理活性。 （2）鉴于目前尚无血三七质量标准，在化学研究的基础上，首次采用高效液 相色谱法（HPLC法）对9个不同产地的血三七进行了指纹图谱研究，结果证实不同 来源血三七的特征指纹图谱具有较高相似性，其相似度均在90% 以上，尚存一些细 小差异
4、。这种结果符合中药指纹图谱质量要求。因此，该方法的建立不仅为鉴别不 同产地血三七提供了依据，而且为该药材质量标准制定提供了科学依据。 （3）采用体外实验对血三七抗菌活性进行了初步筛选研究。利用药敏纸片法 检测了血三七粗提物的乙酸乙酯、正丁醇部位的抗真菌活性；用琼脂稀释法测定血 三七抗真菌活性的最小抑菌浓度；利用平板法，考察了光照、温度、pH值对其抗菌 II 华华 中 科中 科 技技 大 学 博 士 学 位 论大 学 博 士 学 位 论 文文 活性的影响。结果表明血三七具有良好的抗真菌效果，且药效稳定，受外界因素干 扰小，特别是极性较大的正丁醇部位，只需0.013 mg/mL 就可显示出较强抑菌
5、效果。 （4）采用体外细胞模型，对血三七总提物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正 丁醇部位、水部位提取物及从乙酸乙酯部位分离得到的化合物Emodin-8-O-D- glucoside (EG) 进行了促骨折愈合机理研究。以MC3T3-E1细胞系及从小鼠头盖骨分 离得到的成骨细胞为模型，以CCK-8法检测成骨细胞增殖，流式细胞术检测细胞增 殖周期，ELISA法检测碱性磷酸酶(ALP)活性、前列腺素E2 (PGE2) 的含量。结果显 示，低剂量的总提物 (0.1-100 g/mL) 及各提取部位 (0.1-100 g/mL) 和化合物 (0.1-100 ng/mL) 均能促进成骨细胞增殖和DNA合成：
6、总提物和各部位作用下的S期 比例从9.78%增加到27.29%，而化合物则是从16.34%增加到32.16%。这说明血三七 促进成骨细胞增殖是通过促进细胞S期比例来实现的。同时，各提取物及化合物EG 对成骨细胞分化均有一定作用，且呈剂量依赖关系。需特别指出的是，化合物EG不 仅具有良好的细胞增殖效果，而且能显著促进成骨细胞分化，这种作用主要体现在 增加成骨细胞ALP的活性和降低PGE2的含量上。上述结果表明血三七促进骨折愈合 的机理是：血三七直接刺激成骨细胞的增殖和分化，化合物EG是实现这种活性的主 要物质基础。 （5）采用体内实验对血三七的镇痛活性进行了验证。通过小鼠热板法和醋酸 所致小鼠扭
7、体法，对血三七总提物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及水 部位的高、中、低三个剂量组进行了实验。结果发现，三种浓度的上述血三七各提 取物均可使热板所致小鼠舔足的痛阈值显著提高 (p0.05), 使醋酸所致小鼠扭体次 数显著减少 (p0.01), 且水部位和正丁醇部位镇痛效果要好于总提物、石油醚部位 及乙酸乙酯部位。 关键词：关键词：血三七 化学成分 指纹图谱 抗真菌活性 促骨折愈合机理 镇痛活性 III 华华 中 科中 科 技技 大 学 博 士 学 位 论大 学 博 士 学 位 论 文文 Abstract Traditional Chinese medicine Xuesanqi is
8、the root tuber of Polygonum amplexicaule D. Don var. sinense Forb. It is the commonly used raw material for medicine among Enshi minorities in Hubei Province. It has many medical functions, such as improving blood circulation, maintaining normal menstrual flow, and curing various fractures, muscle i
9、njuries or pain from tissue swelling. Especially, Xuesanqi has been demonstrated to be an effective herb to treat rheumatism, atherosclerosis and to have antifungal activity. In addition, its distribution is very wide, there are a large number of wild and home-grown Xuesanqi in China. However, so fa
10、r, there are sporadic studies about it, and lacks systematical research, which block its further applications. Therefore, the objective of the study is to isolate and identify its most effective compounds by various chromatographic techniques and to set up fingerprints of Xuesanqi from different are
11、as in order to provide an academic basis for the scientific evaluation of the quality of Xuesanqi. On this basis, by means of modern pharmacological methods, it was tried to prove its different medical effects, including antifugal activity, mechanism of promoting the healing of bone fractures, and a
12、nalgesic activity, etc, which would provide the scientific basis of developing new drug in the future. The main work and its innovations of this research are listed below: (1) Such chromatographic techniques, including TCL, normal-phase silica gel column, reverse-phase silica gel column, polydextran
13、 gel and semi-preparative high performance liquid colum were employed in this study. About 40 compounds were obtained by the above chromatographic techniques from EtOAc fraction of Xueshaqi. By means of modern spectroscopic methods (e.g. UV, IR, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, EI-MS), 23 compounds were final
14、ly identified. Among them, 20 compounds were isolated for the first time from this plant. Moreover, 5 compounds were first obtained from Polygonaceae. A majority of these compounds belong to flavonoids and anthraquinones, which show great pharmacological activity. (2) Since the quality standards of
15、Xuesanqi have not been established by now, on the basis of its chemical composition analysis, the fingerprints were set up by HPLC for the IV 华华 中 科中 科 技技 大 学 博 士 学 位 论大 学 博 士 学 位 论 文文 flavonoids of Xuesanqi from nine different regions. A total of 11 peaks were found, and their relative retention ti
16、me and relative peak area ratio of the scope were determined. The results showed that each fingerprint of P. amplexicaule exhibited 90% of similarity despite of their different origin. Thus, the results met the quality requirements of fingerprint. The establishment of this method not only can help to identify Xuesanqi from different localities, but also can provide scientific evidence to formulate the quality standards of Xuesanqi. (3) The anti-fungal activity of secondary metabolites fr
