《东亚钳蝎毒素bmtxkβ的基因结构分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《东亚钳蝎毒素bmtxkβ的基因结构分析（84页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、武汉大学 硕士学位论文 东亚钳蝎毒素BmTXK的基因结构分析 姓名：肖帆 申请学位级别：硕士 专业：生物学、微生物学 指导教师：李文鑫 20030601 摘要 蝎毒由蛋白质和非蛋白质两组分组成。非蛋白质成分含量较少，蛋 白质成分中以毒素含量最高，是引起哺乳动物( 包括人) 、昆虫和甲壳类动 物死亡和麻痹的主要活性物质，具有重要的理论和应用价值。竭毒素作 用的靶目标为细胞膜上的离子通道，它们可特异识别并结合于离子通道， 阻断离子的通过或改变通道的机制影响其开闭，从而行使不同的生理功 能，依据其特异性，蝎毒素可分为N a + 、K + 、C 1 和c a 2 + 通道毒素家族。 通常，N a +
2、通道毒索是长链毒素，由6 0 7 6 a a 组成，含有4 对二硫键； 氯毒素和短链K + 通道毒素a K T x 由2 8 4 1 a a 组成，含有3 4 对二硫键： 4 个长链K + 通道毒素B K T x 由6 0 6 5 a a 组成，含有3 对二硫键；C a 2 + 通道毒素长度和结构趋异性比较大。尽管蝎毒素的长短、来源和功能各 不相同，它们的基因都有着大体相似的结构：蛋白质前体都有一段2 0 a a 左右的信号肽，蝎毒素的基因中一般没有内含子或有一个内含子位于信 号肽c 末端。钠通道蝎毒素的内含子一般是4 0 0 6 0 0 b p ，钾通道蝎毒素 的内含子一般是8 0 b p
3、左右，氯离子通道蝎毒素的内含子是9 6 b p 。 根据B l H X 家族的T s T X K l 3 和A a T X K l 3 的保守序列设计引物，运用 P C R 筛库策略，我们从中国产东亚钳蝎毒腺细胞e D N A 文库中筛选到 1 3 - K T x 毒素样肽前体：B m T X K B 。B m T X K p 前体由9 0 个氨基酸组成，信 号肽2 2 a a ，前导肽7 a a ，成熟肽6 0 a a ，C 末端存在额外L y sa a 切除过 程。尽管P m T X K l 3 的核苷酸序列和氨基酸序列与另外3 个长链钾通道毒 素T s T X K l 3 、A a r
4、X K l 3 和B m T X K l 3 2 缺乏明显的同源性，但其长度、e D N A 组织结构和二硫键的组成与位置都一致，表明B m T X K l 3 是一个全新的长 链钾通道毒素。基于B m T X K l 3 的c D N A 序列，我们以B m T X K p 的成熟 肽编码区两端的正、反向引物，以基因组为模板进行P C R 扩增，发现在 B m T X K 3 成熟肽第十个氨基酸残基v 的密码子G T T 中插入了长8 8 6 b p 的内含子。此内含子A T 含量达7 l ，5 拼接位点和3 拼接位点为5 一 G 】g t a g a g - 3 和5 - - t t t
5、e a gIT - - 3 ，符合边框为g t a g 的内含子一般特 点。以B m T X K I je D N A 的5 U T R 、信号肽编码区设计的引物未扩增到任 何带。 考虑到其他已知的蝎毒素基因的内含子都定位于信号肽编码区，通 过V E C T O R E T T E 方法，我们在信号肽C 末端倒数第二个氨基酸残基E 的密码子G A G 中发现一大于9 9 7 b p 的内含子，这个内含子与其它蝎毒素 的内含子位置一致，但较长，符合内含子的一般规律：A T 含量为6 9 ， 明显高于外显子、5 非翻译区和3 非翻译区的A T 含量。3 拼按位点为5 - - t t t g a c
6、 a gIA 一3 ，估计应符合内含子的g t a g 规律。同时我们克隆到 B m T X K l 33 侧翼区1 5 8 1 b p ，核苷酸序列经N C B l 分析，与其它己知的蝎 毒素基因的3 侧翼区同源性很低，A T 含量较高，达6 2 3 ，P o l y A 信号 为A ：兀A A A ，与其它大部分基因的p o l y A 信号A A T A A A 不同。同时也 发现了几个保守的顺式作用元件：M A L TB o x ( 1 1 4 9 ：G G A K G G A ) ， N F E l ( 11 9 2 ：W G A T A M S ) ，S P l 结合位点( 8 9
7、 9 ：G G G C G G ) 。 四个1 3 - I S ( X ) Q O O l N K F F L M C L II F P I 虬甜【黼B Y P L 胂H e l c T T E c s a V 帆I 删渊S E c T Y Y E Y B c Y c F 札印D 陋I G P M K D l T K K Y ( V O I I P S 纠蚌呲I I F P I 啪v L 湖帆娴B I ( 丌E 眦I P 胛懈T I ( v r 懈“髓柚帆E 忡l 籼l T 球Y I l P S X m 拍c l c T 、f 瞄娜印U 问竹C 嗍I c T “Y Y T 舶批a 工舶懵乩呻饼
8、眦l K D A T K G Y C O V O I N S Q 籼I F L W I P I 岫l F 褂口0 n T v 略n P E c L L s 埘例暇帐蝌W 螂啪叫撑玳n U 褂C 忆E l T 雕滞T T II N VVIPI眦秫KY啪鹊“坤邱U瑚w叫哐cT州州加哺YccLLs甜昝札m阱IT雕gYcDTPlIN ) 酥嘲吖糨淋舻印L L S N 忧Y I I 即佩坩赋吖c c L L Y c 帕L s 叩玎C V L E I S O A R I 饿y C O F V T I N S 0 孙洲 、f D 珊锄唯c L 上S H Y c Y N 酏n ( v l 盯艇煎剞q ：u -
9、 s c Y 眦筑科口C V L E I f 籼F v T I N 啪疆- 0 叫I L F I S C L L L I D I V V 0 姝E 州U 难O 弧S c F I R P T 旺c 1 U 氍蚴_ r c 胛帅T c Y 札H 啊怅W 呻删睬 S O 蛐H l L F I 龇l q l W 髓K “扎期唾搿I 盼镐S E 铱I 燃笛托黼柏T 针缸蹦氍科柑州瀚【e B 腻 洲1 睢吖M 惦K e 铱1 1 C F L T e Y 洲T E c T “蝴Y c 洲B L P E S 佩l 耵S H N K G S O O l I 蝴Y P V D S G H C X Y 比U m 日
10、帅L l 走日墩如“Y a W 删越H “ I 讣1 X T S Q X C 糟) A S O Q 1 2 N K G N l L F I 山1 日I W E 铱E 斛L 帅H E 惴I 阱毽0 T 锚旺I 糕B 渤Y _ P 加Y 甜a L 嗍吖K v 吣m 0 眦 S 0 0 0 0 1 3 嘲B L U I T A K 车 V L l 0 1 w I 0 Y L v D 球时咖m 叫煳忧慷融圈I 锄S Y B Y C 懵慨S 嘴T P W P L P 崃T C S 矾 s O O 1 删卅m I s L 札“v 1 照V 删I 眦n F 删_ f c 畦E c T n m E Y 卧S
11、P Y 呲Y c T 札嗍W 豫廿隙 S O 叫叫W V C L L T 舳T 刚口d _ r P v E 洲I C 捌T 叫 Y c 淋旧甜口C D Y C Y I I V H I L c Y O Y 6 L P 髓盱T I 【眯雠S C ) S l 札W 蚶J T 舳T 朗嘲哺弹虻憎删l 镧憎埘啪n 麒哟粼I L c 忧憎朋昏T l 【T I 猷c l c S c l c S O ( X ) 0 1 7 K 曲T 哪睢K F S c F I 眦C Y 瓤- K 删删I K V I I O Y A l l 4 S O Q 0 0 1 8 M N S L I II T A C L Y L I
12、B T V 姝T L V 州烈黼删锚陡雠嘲瑚Y 甜瞄啪Y c E e L s 峙T P T - P L 升哪m 强 ) _ $ O O Q O t 9 V K D G y Iv I 由褂I G T Y F 饿痢W 口I E E c n 鼬T l 对荆呐吖c 1 限忭憎脯T 鼬P 豫侧 S 粼啪Y P 垤加胙v c F 盯M I q - 眯鹋眦Y 州I L c T c 帕L P D 嘲T l c T H e m S 0 0 0 0 2 1 K 髓Y 岫畦I ( F S 砰P M q T c 盯t L M 篱时“ m Y I T N m $ 0 0 0 Q 2 2 L K D Q y I D 褂帕
13、丌F T H T 嗍旺c v 日期咖Y - 删洲埘m 洲T v B R 瞄瑶 ) S 2 V 捌B n I 柏潴糯”T 啪渊雠T E C T K 邮钳- 雠T 翎黼I H 啪I R I P Q 豫 s 0 0 K 呲Y P v E 阱 薛洲Y l c L 口附吖c v 幅阳a W G L P 引I L X 尊T K T s G R C s O 啦5 州H L l S L A L L L L L G V E S Y R D A Y I l ( 1 I Y - 瞄，T E 僻舶州T I a 岫、潍札口肫K T 鞠 C 骱Y L P D N 忡I R 忭雠q f 玳 ) _ $ O O Q 0 2
14、6 L K D G Y l 讲饿c T F F 嗍 Y 溉涨腿融Y C Q 黼Y 铷柚荫Y I ( L P O R 幅I 旺K B 附I $ O G 0 0 2 7 E R D G Y I V G L H N C V Y p G L N P y 口壮C T 蛐卧T $ Y C M _ d I X W G N A G y c Y L P 黼l 眦蚋C c Y s 船讯卧T I 帕P E H C V Y E C k K N S Y L 。T 州触啪Y c 州L e 嘲融“甜e I D I F 删( V P t R l E 黼 S W V R D A Y I A K N Y I , I C V Y
15、E 砰R 皓Y C N D L C T K N G A , S 辅托删W 球W 柏吣- c Y 札O H 忭l 酣f 瑚粘H S ( X ) 0 0 3 0 V R D A y I 州Y m v Y F 咖K Y L c 俅幅驰Y 。潍舶村删帕粉札科P I 刚陟哪憾 ) s 3 1 棘t l 加S B 犯丌1 C 忡Y a 札c T 删嘲Y 哦T 删 m I 儿P D m I R I S 鹋O R s D 吣2 “Y II 呲T 阼饰烈黼洲B 甜姒舯伯黼Y I c L P D 只幅I K E K G 船N 锄伽0 3 3 Y I 黜碾啪a W s c U 雠0 C 淋E 姒n 帕S Y o Y a 盯粕L 柏啪鼎U 叼H 订c s E T N T D a 0 0 0 3 响Y l 非肋“L F 州目淋E 她怕B 滞丫c 盯稍L 渊睫吐P 脒S E 州T O 3 5 蛐剞嘲e 洲T c 怅L e 日科：懈铱删I 辩Y 甜C 怕阳a 佗E 峭T 口T L 刖( T C 6 啪T I 褂唰墙臼U n 月翱涮搬删Q Y c 耵粕L 翻陡札阳洲S 盯盯 S 0 0 0 G 3 7 1 Y I V 1 1 1
