《东方鲎脂多糖结合蛋白和小鼠抗菌肽的基因克隆、表达及生物学功能研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《东方鲎脂多糖结合蛋白和小鼠抗菌肽的基因克隆、表达及生物学功能研究（110页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、上海交通大学 博士学位论文 东方鲎脂多糖结合蛋白和小鼠抗菌肽的基因克隆、表达及生物 学功能研究 姓名：孙向军 申请学位级别：博士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：张惟杰;吴祥甫 20041105 博士学位论文 第 - i - 页 东方鲎脂多糖结合蛋白 Factor C 和小鼠抗菌肽 Bin1b 的基因克 隆表达及生物学功能研究 摘 要 1 . 细菌内毒素是革兰氏阴性菌G 菌 细胞外壁的主要成分它是 一种复合糖脂又称为脂多糖L i p o p o l y s a c c h a r i d e L P SL P S 主要通 过两个方面发生作用 一方面 它可以在细菌周围形成一层稳固的保护屏
2、障以逃避抗生素的作用从而有利于 G 菌在人体内的存活和增殖 另一 方面L P S作用于寄主细胞可诱导诸如肿瘤坏死因子T N F 和白介素 I L 等细胞因子的释放从而导致多种炎症介质参与的级联反应使机 体处于一种自身无法控制的混乱状态 严重时可造成脓毒性休克 所以细 菌内毒素 L P S 在 G 菌引起的感染中起着重要作用 在鲎血细胞蛋白质 C 因子F a c t o r C 具有对 L P S 的高特异的结合活 性这种特性将有助于中和细菌内毒素从而可用于治疗 G 菌引起的各 种感染性疾病在抗内毒素的治疗中表现出潜在的药用价值C 因子成熟 肽是一种具有马赛克结构的新型丝氨酸蛋白酶同时它具有 L
3、 P S 结合区 可以结合 L P S 并抑制 G 菌的生长 目前用于功能研究的 F C 主要都是从天然鲎血细胞裂解物的分离纯化 中得来的这存在以下几方面问题首先鲎类是一种稀少的物种这就大 大局限了从鲎血裂解物中分离天然 F C 的样品来源 其次 F C 含量有限 且 需在无菌环境下纯化 这使分离纯化相当困难 同时天然裂解物对内毒素 博士学位论文 第 - i i - 页 的敏感性还因每次不同来源的样品而异 另外 利用氨基酸合成法合成的 具有 L P S结合活性的肽段成本太高且化学合成法难以完善肽的修饰加 工因此为了获得大量可用于研究与临床治疗的 F C 蛋白质只有利用 基因工程的手段才有可能大
4、量制备具有生物活性的重组蛋白以满足应用 的需要目前国际上尚没有东方鲎来源的 F C 基因重组克隆表达的报道 所以我们的目标就是利用基因工程手段大量制备具有生物活性的重组蛋 白质 首先本文首次将 F C 基因在 T n 细胞中成功地进行了表达通过体外 L P S 中和活性及抑菌活性测定证明表达产物具有良好的生物学活性F C 在 T n 中表达不形成包涵体易纯化活性损失小利用亲和层析柱纯化 重组表达的 F C 得到纯化的蛋白质为 1 8 0 u g / l 纯度达到 9 4 % 之后为了深入了解 F C 中的不同结构域对其生物活性的影响我们除 了表达了 F C全长片段外还在 T n细胞中表达了 F
5、 C的四个截短的片段 C E S 1 2 3 L C E S 1 2 3 S 1 2 3 L 和 S 1 2 3 并比较了这五个肽的体外抑菌活性 及 L P S结合活性实验结果表明r F C的抑菌活性及 L P S结合活性与 r C E S 1 2 3 L 的抑菌活性及 L P S 结合活性无明显差别 说明 F C 的活性部位位 于 C E S 1 2 3 L 片段中此外r C E S 1 2 3 r S 1 2 3 及 r S 1 2 3 L 的抑菌活性之间也 无明显不同 可推断出 C y s - r i c h 结构域 E G F - l i k e 结构域及 L e c t i n -
6、l i k e 结构域并不存在活性位点因此F a c t o r C全长或其截短片段 C E S 1 2 3 L 中的活性区域应位于 S 1 2 3 中此外r C E S 1 2 3 L 的抑菌活性及 L P S 结合活 性明显高于 r S 1 2 3 的抑菌活性及 L P S 结合活性 由此可推断尽管 C y s - r i c h 博士学位论文 第 - i i i - 页 结构域E G F - l i k e结构域及 L e c t i n - l i k e结构域中不存在活性位点但 当它们同时存在时可提高 S 1 2 3结构域的生物活性C y s - r i c h结构域 E G F -
7、 l i k e 结构域及 L e c t i n - l i k e 结构域的存在可能会有利于 S 1 2 3 结构的 形成及稳定 我们筛选出的 C E S 1 2 3 L 片段与 F C 全长相比截掉了与活性无关的区 域在 T n 细胞中的表达量明显高于 r F C 高表达量及与 F C 相近的活性预 示出 C E S 1 2 3 L 在医药领域的应用前景 2 生殖系统感染一直是世界性的健康问题但迄今为止对于生殖系 统的防御机制还知之甚少附睾是与精子成熟储存保护相关的雄性生 殖器官在性活跃群体中约 5 1 0 % 发生附睾炎并有 2 0 4 0 % 导致不育 这显示附睾是性传播细菌的储存库
8、并且与生殖系统的感染有关B i n 1 b 是从小鼠的附睾中发现的类- 防御素分子其基因编码 6 3 个氨基酸其 中包括由 1 6 个氨基酸组成的信号肽在结构上与- 防御素类物质一致 并且具有较强的抑菌能力其他- 防御素一般能在宽广范围的上皮组织 中表达而 B i n 1 b则只在附睾中表达其表达特异性及抗菌能力都表明 B i n 1 b 在治疗性传播疾病方面具有重大的临床意义 从已有的 Bin1b 类似的活性肽报导资料分析成熟肽 N 端第一个氨基 酸即甘氨酸是被豆蔻酰化的Bin1b 成熟肽 N 端的第一个氨基酸也是豆 蔻酰化的甘氨酸Gly因此基因工程表达设计首先要明确第一个氨基酸 是否一定是
9、豆蔻酰化的 Gly 基于上述需要我们构建了 P G E X - 4 T - 2 - B i n 1 b大肠杆菌表达质粒 博士学位论文 第 - i v - 页 并成功地在大肠杆菌中表达出 G S T - B i n 1 b融合蛋白质 G S T - B i n 1 b 融合 蛋白经 t h r o m b i n 酶切后 产生了 N 端融合了 t h r o m b i n 酶切位点的氨基酸 的 B i n 1 b 肽而不是 N端为豆蔻酰化的甘氨酸的 B i n 1 b 肽, 这个结果为 我们研究 N端豆蔻酰化的甘氨酸是否为 B i n 1 b 肽抑菌活性所必需提供了 条件 抑菌实验发现由 G
10、S T - B i n 1 b 融合蛋白水解的到的 B i n 1 b 肽能够显著抑 制细菌的生长这个结果表明 N端豆蔻酰化的甘氨酸对于 B i n 1 b 的抑菌 活性不是必需的 这为通过基因工程手段获得大量的 B i n 1 b 生物活性肽奠 定了基础 B i n 1 b 在大肠杆菌中的表达量不高 仅为 1 . 3 m g / l 还不能达到大量生 产的要求为了能够获得大量的 B i n 1 b 蛋白质我们尝试在大肠杆菌中表 达 B i n 1 b 的串联产物 实验结果表明串联两个 B i n 1 b 单元的融合体能够成 功地在大肠杆菌中获得表达 2 Bin1b 在大肠杆菌中的表达量为 2
11、.4mg/l 串联表达显著提高了 Bin1b 表达量 由细菌表达的具有生物活性的 Bin1b肽可用于生物化学和细胞生物学 研究对于阐明保护泌尿器官免受性传播微生物感染的机制开发治疗性 传播疾病的有效药物有着重要的意义 关键词 脂多糖东方鲎抗脂多糖因子C 因子克隆T n 细胞大肠 杆菌 L P S 中和活性抑菌活性B i n 1 b- 防御素N 端豆蔻酰化 G l y , 串联表达 博士学位论文 第 - v i - 页 G E N E S O F L P S - B I N D I N G P R O T E I N F A C T O R C F R O M T A C H Y P L E U
12、 S T R I D E N T A T U S A N D A N T I M I C R O B I A L P E P T I D E B I N 1 B F R O M R A T S C L O N I N G E X P R E S S I O N A N D A N A L Y S I S O F T H E I R B I O L O G I C A L A C T I V I T I E S A B S T R A C T 1 . L i p o p o l y s a c c h a r i d e ( L P S ) , o r e n d o t o x i n , i
13、 s a m a j o r m e d i a t o r o f s e p t i c s h o c k , a s e r i o u s c o m p l i c a t i o n o f g r a m - n e g a t i v e ( G) b a c t e r i a l i n f e c t i o n s i n h u m a n . L P S c a n p r o v o k e c y t o k i n e r e l e a s e a n d p a t h o p h y s i o l o g i c e f f e c t s a f
14、t e r a d m i n i s t r a t i o n . A d m i n i s t r a t i o n o f p u r i f i e d L P S o r a v a r i e t y o f L P S - f r e e r e c o m b i n a n t m e d i a t o r s c a n r e p r o d u c e m u c h o f t h e p a t h o p h y s i o l o g y o f g r a m - n e g a t i v e s e p s i s . P r o t e i n
15、s f r o m T a c h y p l e u s t r i d e n t a t u s h e m o c y t e s , n a m e d f a c t o r C F C , w h i c h h a v e a n a n t i b a c t e r i a l e f f e c t o n t h e g r o w t h o f g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a b y b i n d i n g L P S . F a c t o r C i s a n e n d o t o x i n - s
16、e n s i t i v e , i n t r a c e l l u l a r s e r i n e p r o t e a s e z y m o g e n , w h i c h w a s m a d e u p o f 1 0 1 9 a m i n o a c i d r e s i d u e s . F a c t o r C h a s a m o s a i c s t r u c t u r e o f s e v e r a l d o m a i n s i n c l u d i n g a 2 5 a m i n o a c i d s s i g n a l p e p t i d e i n i t s N t e r m i n a l . 博士学位论文 第 - v i i - 页 S o f a r n o r e s e a r c h e s o n r e c o m b
