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1、分子生物学的实验方法和技巧 张照康 2016年5月31日 PCR原理 A 琼脂糖凝胶电泳 B 细胞培养技术 C LOREM IPSUM DOLOR P C R 原理 P C R 原理 DNA半保留复制 是DNA在进行复制的时候链间氢键断裂，双链解旋分开，每条链作为模板 在其上合成互补链，经过一系列酶（DNA聚合酶、解旋酶、链接酶等）的 作用生成两个新的DNA分子。子代DNA分子其中的一条链来自亲代DNA，另 一条链是新合成的，这种方式称半保留复制。 P C R 原理 聚合酶链式反应（英文全称：Polymerase Chain Reaction） ，简称PCR。 聚合酶链式反应(PCR)是体外酶
2、促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变 性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行, 使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等 特点。 P C R 原理 PCR技术原理 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作 用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互 补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可 以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度 变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、 dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 P
3、C R 原理 PCR工作原理 PCR由变性退火(复性）延伸三个基本反应步骤构成： 模板DNA的变性：模板DNA经加热至94左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成 的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至4060左右，引 物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸：DNA模板与引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72左右，以dNTP为反应原 料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保 留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多
4、的“半保留复制链”，而且这 种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基 因扩增放大几百万倍。 P C R 原理 P C R 原理 模板来源 目标生物的细胞，组织，个体等具有活细胞组织中提取。 P C R 原理 设计引物应遵循以下原则： 引物长度：15-30bp，常用为20bp左右； 引物扩增长度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增至10kb的片段； 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现 非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排 列。 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间
5、互补，特别是3端的互补，否则会 形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末 端碱基不配对而导致PCR失败。 引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这 对酶切分析或分子克隆很有好处。 P C R 原理 酶，dNTP（原料） 公司购买 P C R 原理 仪器： P C R 原理 1、加样 P C R 原理 2、PCR 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 脂糖凝胶电泳实验原理 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔 径的大小决定于琼脂糖的浓度。 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在
6、外加电场作用下向正极泳动。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA 的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区 带。 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳法分离DNA 主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系，因而就可 依据DNA分子的大小使其分离，该过程可以通过把分子量标准参照物和样品 一起进行电泳而得到检测。 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 细胞培养技术 细胞培养技术 细胞培养技术 细胞培养技术 细胞复苏 主要的实验操作步骤如下： 将完全细胞培养液（500ml DMEM+50ml FBS+5ml 青霉素/链霉素）放入
7、37水浴锅中预热15-30分钟。同时将窗镜台的紫外打开照射； 将以前冻存在液氮管中的细胞取出来，快速的放入37水浴锅中融化，融化期间要不停的轻轻晃动细胞冻存管，加速细胞的融化，融化时间 大约为2-3min； 将细胞冻存管用75%的酒精灭菌，然后将细胞冻存管中的细胞转移至另一个装有10ml的离心管中，然后用移液枪一滴一滴的加入细胞培养液 ，在此过程中不断轻轻晃动10ml离心管，使其混匀； 将10ml离心管封口，然后放入离心机中，室温800g，离心时间3min； 将10ml离心管用75%的酒精灭菌，然后放入窗镜台中，用吸液器将细胞培液吸掉，在用新鲜培液将细胞沉淀轻轻吹打均匀，转移至6cm细胞板 中
8、，前后左右轻轻晃动几下； 将复苏好的细胞放入细胞培养箱中培养，6-8小时后换一次培养液（6h后细胞基本上贴壁），然后继续培养。 注：每一个拿进窗镜台的东西都要用75%的酒精擦拭一遍，防止污染 细胞培养技术 细胞培养技术 细胞传代 一般是当细胞的贴壁密度为70-90%左右的时候进行传代。主要的实验操作步骤如下： 将完全细胞培养液（500ml DMEM+50ml FBS+5ml 青霉素/链霉素）、0.25%胰酶以及1xPBS放入37水浴锅中预热15-30分 钟。同时将窗镜台的紫外打开照射； 用75%酒精擦拭手套、窗镜台台面、细胞培养液瓶、胰酶瓶以及1xPBS瓶； 将细胞培养皿从细胞培养箱中取出来，
9、放入窗镜台中，用吸液器将细胞培养液吸掉，加入适量的1xPBS，轻轻晃动细胞培养 皿； 用吸液器将1xPBS吸掉，然后加入适量的0.25%胰酶，然后放入37培养箱消化1-5min，根据细胞贴壁性能确定时间； 细胞从壁上消化下来后，用移液枪轻轻吹打细胞，使其消化成为单个细胞，然后加入等量的细胞培养液，终止细胞消化； 将细胞培养皿中的细胞转移到15ml的离心管中，然后将15ml离心管转移至离心机中，室温800g，离心3min； 将15ml离心管用75%的酒精灭菌，然后放入窗镜台中，用吸液器将细胞培液吸掉，在用新鲜培液将细胞沉淀轻轻吹打均匀， 转移适量比例的细胞至几个10cm细胞板中，前后左右轻轻晃动
10、几下，使其均匀铺板； 将已经传代好的细胞放入CO2细胞培养箱当中培养。 细胞培养技术 细胞培养技术 细胞冻存 首先配置新鲜的冻存液：90%的完全培养基（DMEM+10%FBS（FBS可以适量的增加至20%）+5%青霉素与链霉素） +10%DMSO（DMSO需要过滤除菌）； 冻存步骤和传代步骤类似，用75%酒精擦拭手套、窗镜台台面、细胞培养液瓶、胰酶瓶以及1xPBS瓶； 将细胞培养皿从细胞培养箱中取出来，放入窗镜台中，用吸液器将细胞培养液吸掉，加入适量的1xPBS，轻轻晃动细胞培养 皿； 用吸液器将1xPBS吸掉，然后加入适量的0.25%胰酶，然后放入37培养箱消化1-5min，根据细胞贴壁性能
11、确定时间； 细胞从壁上消化下来后，用移液枪轻轻吹打细胞，使其消化成为单个细胞，然后加入等量的细胞培养液，终止细胞消化； 将细胞培养皿中的细胞转移到15ml的离心管中，然后将15ml离心管转移至离心机中，室温800g，离心3min； 将15ml离心管用75%的酒精灭菌，然后放入窗镜台中，用吸液器将细胞培液吸掉，在用新鲜的细胞冻存液将细胞沉淀轻轻吹 打均匀，然后将细胞转移到冻存管中，每个冻存管可加入1ml左右的细胞冻存悬液； 将细胞冻存管放入事先已加好常温异丙醇的程序降温盒内，然后将程序降温盒放入4度冰箱2h，在放入-80度冰箱一晚，第二 天将已降温好的细胞冻存管转移到液氮中长期冻存。 细胞培养技术 谢谢大家！
