《与prrsv核衣壳蛋白相互作用的宿主蛋白的筛选与验证》由会员分享，可在线阅读，更多相关《与prrsv核衣壳蛋白相互作用的宿主蛋白的筛选与验证（60页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、分类号 密级 华中农业大学硕士学位论文 与P R R S V 核衣壳蛋白相互作用的 宿主蛋白的筛选与验证 1 8 3 0 5 4 9 S c r e e n i n ga n dI d e n t i f y i n go fH o s tP r o t e i n sI n t e r a c t i n gW i t h P R R S VN u c l e o c a p s i dP r o t e i n 研究生：李婷婷 导师：方六荣教授 指导小组：方六荣教授 肖少波副教授 江云波副教授 专业：预防兽医学 获得学位名称：农学硕士 研究方向：动物病毒学 获得学位时间：2 0 1 0 年
2、6 月 华中农业大学动物科技学院动物医学院 二。一。年六月 _ _ 。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 。_ _ _ _ _ _ ；1 1 1 1 111 11 1 11 11 1I I II I IIl 华中农业大学学位论文独创性声明及使用拨Y 仪1 书7 9 9 8 3 0 学位论文 楚否淼镪舀 如需保密，解密时间年月 曰 独创性声明 本人声蹋所星交的论文是我个人在导痨指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大
3、学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一藏工作的同志 对本研究所儆的任何贾献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究垒签名：槲 对闾：洲。每刍月 7 疆 学位论文使用授权书 一 本人完全了解“华中农韭大学关于保存、使用学位论文的规定”，翠学生必 须按照学校要隶提交学位论文的印劂本和电子版本；学校有权保存提交论文的印 刷版和电子版，并提供目录捡索和阅览服务，可以采用彩印、缩印或扫描等复制 手段保存、汇编学位论文。本入同意华中农业大学可以瘸不溺方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全都或部分内容。 注：保密学位论文在鼹密后适用于本授权书。 学位论文作者签
4、名：赫旃 导师签名： 砉乡，予， _ 签名嚣期：加f o 年匆月7 日签名日期：2 - o ( 0 年6 月目 与P R R S V 核农壳蛋白相互作用的宿主蛋白的筛选与验证 目录 摘要要。1 1 文献综述6 1 1 猪繁殖与呼吸综合征6 1 1 1P R R S V 的病原学特征6 1 1 2P R R S V 分子生物学特征7 1 1 3P R R S V 致病机理7 1 2P R R S VN 蛋白7 1 2 1P R R S VN 蛋白的结构8 1 2 2P R R S VN 蛋白的转定位机制1 0 1 3 研究蛋白质与蛋白质相互作用的方法1 0 1 3 1 蛋白片段互补技术。1 0
5、1 3 2 荧光能量转移技术1 1 1 3 3 噬菌体展示技术1 1 1 3 4 表面等离子共振技术1 2 1 3 5 免疫共沉淀12 1 3 6 谷胱甘肽巯基转移酶p u l ld o w n 技术1 3 1 3 7 酵母双杂交技术13 2 材料与方法一1 6 2 1 材料16 2 1 1 菌株，毒株和细胞1 6 2 1 2 载体与质粒1 6 2 1 3 主要试剂来源18 2 1 4 培养基、抗生素配制1 9 2 1 5 缓冲液及其他使用溶液2 0 2 1 6 引物2 3 2 2 试验方法2 3 2 2 1 钓饵质粒p G B K T 7 - N 的构建2 4 2 2 2 互作蛋白的筛选2
6、6 2 2 3 阳性克隆的初步鉴定2 8 2 2 4 酵母回返试验对蛋白互作的验证2 9 2 2 5 荧光共定位试验对蛋白互作的验证2 9 2 2 6G S T - p u l ld o w n 试验验证蛋白的相互作用2 9 2 2 7S N P R G 对P R R S V 增殖的影响31 3 1 钓饵质粒p G B K T 7 N 的构建3 4 3 1 1P R R S VW u H 3O R F 7 基因的扩增3 4 3 1 2 构建钓饵重组质粒3 4 3 2 钓饵质粒p G B K T 7 N 转化Y 18 7 酵母菌株及相关检测3 4 3 2 1 钓饵质粒p G B K T 7 N
7、转化Y 18 7 酵母菌株后自激活活性的检测3 5 3 2 2 钓饵质粒p G B K T 7 N 转化Y 1 8 7 酵母菌株后对其毒性的检测3 5 3 3 互作蛋白的筛选及验证3 5 华中农业大学硕士学位论文 3 3 1 阳性克隆的营养缺陷型筛选3 5 3 3 2 阳性克隆的1 3 半乳糖苷酶检测3 6 3 3 3 阳性克隆的序列分析。3 6 3 3 4 酵母回返试验对蛋白互作的验证。3 6 3 3 5 荧光共定位试验对蛋白互作的验证3 9 3 3 6G S T - p u l ld o w n 试验对蛋白互作的验证4 2 3 4 对S N R P G 抗P R R S V 增殖作用的检测
8、。4 6 3 4 1 不同剂量S N R P G 干扰分子的干扰效率的检测4 6 3 4 2 绝对荧光定量P C R 检测s i R N A 处理后细胞中P R R S V 增殖的变化4 6 3 4 3T C I D 5 0 检测s i R N A 处理后细胞中P R R S V 的含量4 7 4 讨论与结论4 8 4 1 讨论4 8 4 1 1 酵母双杂交系统的假阳性4 8 4 1 2N 蛋白与S N R P G 作用的生物学意义4 8 4 1 3N 蛋白与L G A L S l 作用的生物学意义4 9 4 2 结论4 9 参考文献5 0 致谢5 4 I I 与P R R S V 核农壳蛋白
9、相互作用的宿主蛋白的筛选与验证 摘要 猪繁殖与呼吸综合征( P o r c i n er e p r o d u c t i v ea n dr e s p i r a t o r ys y n d r o m e ，P R R S ) 是 上个世纪8 0 年代末出现的一种严重危害世界养猪业的病毒性传染病，主要引起母 猪的繁殖障碍和其它各年龄猪的呼吸道症状及仔猪的高死亡率。猪繁殖与呼吸综合 征病毒( P o r c i n er e p r o d u c t i v ea n dr e s p i r a t o r ys y n d r o m ev i r u s ，P R R S V
10、) 基因组为单股 正链R N A ，可编码7 种结构蛋白，其中由O R F 7 基因编码的核衣壳蛋白( N ) 在病 毒粒子中的含量最高，保守性强。N 蛋白上含有核定位序列及与R N A 结合的结构 域，与病毒的复制过程密切相关。筛选与P R R S VN 蛋白相互作用的宿主蛋白有利 于进一步阐明病毒的感染机制以及宿主抗病毒的机制。鉴于此，本研究通过酵母双 杂交技术从猪脑c D N A 文库中筛选了与P R R S VN 蛋白相互作用的宿主蛋白，并进 行了验证，主要研究内容如下： 1 与P P R S V W u H 3 株N 蛋白相互作用的宿主蛋白的筛选 扩增了P P R S VW u H
11、3 株O R F 7 基因，插入到载体p G B K T 7 中构建了重组质粒 p G B K T 7 N 。以p G B K T 7 - N 为钓饵通过酵母双杂交技术从猪脑c D N A 文库中筛选与 P R R S VN 蛋白相互作用的宿主蛋白，获得了8 1 个阳性克隆。通过测序分析，获得 了5 个可能与P R R S VN 蛋白相互作用的宿主蛋白。经初步筛选后选择了两个兴趣 蛋白，即：核内小分子核糖核蛋白多肽G ( S N I 冲G ) 和半乳糖苷凝集素( L G A L s l ) ， 进行后续试验。 2 对筛选到的宿主蛋白与P R R S V N 蛋白之间相互作用的验证 利用酵母回返
12、试验和G S T - p u l ld o w n 实验分别在酵母体内和体外证明了筛选到 的两个宿主蛋白S N R P G 和L G A L S l 能与P R R S VN 蛋白发生作用。荧光共定位试 验进一步证实P R R S VN 蛋白能分别与S N R P G 和L G A L S l 在细胞胞浆存在共定位。 3 宿主蛋白S N R P G 对P R R S V 增殖的影响 运用R N A 干扰分子，对细胞中S N R P G 进行干扰后接种P R R S V ，再通过绝对 荧光定量P C R 和T C I D 5 0 试验分别从m R N A 和蛋白水平检测干扰S N R P G 后P R R S V 的增殖，结果表明：干扰了S N R P G 之后对P
