蛋白酶4.14

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1、3 蛋白酶,1,3.1 概述 3.2 常见的蛋白酶 3.3 蛋白酶在食品加工中的应用,主要内容,重点：蛋白酶的分类与特性；肌肉组织蛋白酶对肌肉嫩度的影响；碱性乳蛋白酶对乳品品质的影响；水解度对蛋白质水解产物的影响；蛋白质的限制性水解在食品加工中的应用。 难点：蛋白酶的完全水解和限制性水解在食品加工中的应用。,2,3.1 概述,水解蛋白质中肽键的酶。 水解类型： 外切蛋白酶-从肽链的任意一端切下单个的氨基酸。蛋白质被分解为单个的氨基酸。 内切蛋白酶-与蛋白质内部的肽键反应，水解蛋白质为多肽类或肽类。,3,3.1.1 地位,蛋白酶是食品工业中最重要的一类酶。 应用广泛，如干酪生产、肉类嫩化、植物蛋

2、白质改性等大量使用。,4,植物：菠萝、木瓜、无花果 动物：消化道-胃蛋白酶、胰凝乳酶、羧肽酶、氨肽酶等 微生物：蛋白酶等,5,3.1.2 存在,6,3.1.3 催化反应机理,酶,反应体系中水的量很大时 反应中底物或者其他氨基酸的量很大时,7,一、对R1和R2基团性质有要求 胰凝乳蛋白酶仅能水解：R1是酪氨酸、苯丙氨酸或色氨酸残基的侧链的肽键。 胰蛋白酶仅能水解：R1是精氨酸或赖氨酸残基的侧链的肽键。 胃蛋白酶和羧肽酶对R2基团有特异性要求，如果是苯丙氨酸残基的侧链，水解速度最快。,8,二、氨基酸的构型 蛋白酶的底物-蛋白质和多肽是由L-氨基酸构成的。 三、底物分子的大小 一般没有要求。但酸性蛋

3、白酶有严格要求。,9,四、X和Y的性质要求 肽链内切酶： X和Y必须继续衍生出去， X可以是酰基或氨基酸残基，Y可以是酰胺基或酯基或氨基酸残基。 肽链端解酶：X和Y分别是-H或-OH 羧肽酶：要求Y是-OH，X不是-H时，才表现出高的活力。 氨肽酶：要求X是-H， 并优先选择Y不是-OH。,10,五、对肽键的要求 多数蛋白酶不仅能水解肽键，还能作用于酰胺（-NH2-）、酯（-COOR）和硫羟酸酯（-COSR）等。,11,3.1.4 蛋白酶的分类,一、根据存在的生物体不同分类 （1）植物：菠萝蛋白酶 、木瓜蛋白酶 、无花果蛋白酶 ； （2）动物：胃、胰蛋白酶、凝乳酶（胃）； （3）微生物：139

4、8枯草杆菌、3942栖土曲霉蛋白酶、放线菌蛋白酶,重要,12,酸性蛋白酶： pH13 胃蛋白酶、凝乳酶和许多霉菌蛋白酶 中性蛋白酶： pH68 胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、细菌性中性蛋白酶 碱性蛋白酶： pH911 枯草芽孢杆菌蛋白酶,二、最适作用条件,重要,13,三、作用模式分类,肽链端解酶：从肽链的一个末端开始将氨基酸水解下来。 羧肽酶：从肽链的羧基末端开始。 氨肽酶：从肽链的氨基末端开始。 肽链内切酶：从肽链的内部将肽链裂解。,重要,14,四、活性部位的化学性质分类,1、丝氨酸蛋白酶 肽链内切酶 活性部位含有丝氨酸残基。 酶活性中心的必需基团：-OH 丝氨酸羟基抑制剂

5、：DFP（二异丙基氟磷酸） 胰蛋白酶、胰凝乳酶、弹性蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等都属于此类。,重要,15,2、巯基蛋白酶 活性部位含有一个或多个巯基。 抑制剂：氧化剂、烷基化剂和重金属离子。 激活剂：还原剂、金属螯合剂等。 植物蛋白酶和一些微生物蛋白酶属于此类。,16,3、金属蛋白酶 活性中心：含有镁、锌、锰、钴、铁、汞、镉、铜或镍等金属离子。 在EDTA溶液中透析可以分离出金属离子，但酶活性损失。 抑制剂：氰化物 羧肽酶A、某些氨肽酶和细菌中性蛋白酶属于此类。,17,4、羧基蛋白酶 活性中心：有2个羧基。 抑制剂：对-溴苯甲酰甲基溴或重氮试剂。 胃蛋白酶、凝乳酶和许多霉菌蛋白酶在酸性范围内具有活

6、性。最适pH在24。,18,19,3.2 常见的蛋白酶,3.2.1 巯基蛋白酶木瓜蛋白酶,有：木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶等； 专一性差； 最适pH：6-7.5； 良好的热稳定性。,木瓜蛋白酶,存在于木瓜的汁液中，分子量23900，是由212个氨基酸残基组成的一条多肽链。至少有3个氨基酸残基存在于酶的活性部位，它们是Cys25、His159和Asp158。 当Cys25被氧化剂氧化或与重金属离子结合时，酶活力被抑制，而还原剂半胱氨酸（或亚硫酸盐）或EDTA能恢复酶的活力。,20,21,22,23,酸性蛋白酶是指蛋白酶具有较低的最适pH，而不是指酸性基团存在于酶的活性部位。酶的活性部位含

7、有一个或更多的羧基。 有胃蛋白酶、凝乳酶,24,3.2.2 酸性蛋白酶凝乳蛋白酶,凝乳酶是存在于哺乳期小牛（雏牛）第四胃中的蛋白酶，以无活性的酶原形式被分泌出来。随着小牛的长大，由摄取母乳改变成青草和谷物时，凝乳酶的数量下降，而胃蛋白酶的数量增加。 凝乳酶从无活性酶原转变成活性酶时经受了部分水解，分子量从36000下降到31000，pH5时酶原主要通过自身催化作用激活，而在pH2时，激活过程进行得非常快。,25,凝乳酶在pH5.56.5最稳定，在pH3.54.5由于自我消化而失活。在中性和碱性范围，无凝乳活力。 凝乳酶催化酪蛋白沉淀是干酪制造中非常重要的一步。 原料乳杀菌添加发酵剂、凝乳酶、色

8、素凝块形成排除乳清切块、搅拌、加热（CaCl20.01%）成型压榨腌渍发酵成熟上色挂蜡成品,26,羧肽酶（羧肽酶A和羧肽酶B） 作用机制：相似； 底物特异性：要求底物的C-末端氨基酸的羧基必须是游离的。,27,3.2.3 金属蛋白酶 羧肽酶,苦味肽的形成及脱苦,蛋白质中的疏水性氨基酸是导致蛋白质经水解后产生苦肽的重要原因。 当蛋白质处于天然状态时，这些氨基酸埋藏在蛋白质结构的内部，因而对蛋白质的味道不会产生明显的影响。在酶水解过程中，小肽的数量将增加，从而暴露了这些疏水性氨基酸，当它们同味蕾相作用时就产生了苦味。,28,重要,脱苦方法酶法处理,羧肽酶通过作用于肽链的末端疏水氨基酸，使其水解变成

9、游离的氨基酸，从而达到脱苦去苦的目的。 如果采取有控制的酶水解，使蛋白质的水解反应停止在某一个阶段，使肽链具有足够的长度将疏水性氨基酸埋藏在它的结构的内部，就能减少水解蛋白质的苦味。 蛋白质的限制性酶水解,29,30,3.2.4 丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶,底物特异性：,胰蛋白酶,以无活性前体的酶原形式存在，受肠激酶或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶； 是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。是特异性最强的蛋白酶； 催化蛋白质水解时的适宜pH为7-9，较高pH下自我催化分解； Ca2+对酶具有保护和激活作用。,31,用 途,起消化酶的作用； 能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷

10、脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。 其它： 皮革工业上用胰蛋白酶代替石炭-硫化碱的老传统，脱去动物皮上的毛； 纺织工业上用蛋白酶脱丝胶； 医药工业上用蛋白酶水解酪蛋白或鱼粉，制造水解蛋白和蛋白胨； 日化工业中的加酶洗涤剂，由于加入碱性蛋白酶后易于除去洗涤物上的蛋白污垢。,32,豆浆和鸡蛋 ?,33,一、肌肉组织蛋白酶 组织蛋白酶存在于动物组织细胞的溶酶体内； 当动物死亡之后，随组织的破坏和pH的降低，其被激活，可将肌肉蛋白质水解成游离氨基酸，使肌肉产生优良的肉香风味； 对肌肉成熟过程具有决定性的影响。,34,3.2.5 影响动物食品品质的内源蛋白酶,肉的成熟,35,肌肉宰后会发生一系列变化，使

11、musclemeat 热鲜肉肉的尸僵解僵成熟自体酶解腐败变质 动物刚屠宰后，肉温还没有散失，柔软具有较小弹性，这种处于生鲜状态的肉称作热鲜肉。 肌肉宰后：尸僵成熟腐败,36,尸僵的定义： 屠宰后的肉尸（胴体）经过一定时间，肉的伸展性逐渐消失，由弛缓变为紧张，无光泽，关节不活动，呈现僵硬状态，叫作尸僵。 尸僵的肉硬度大，加热时不易煮熟，有粗糙感，肉汁流失多，缺乏风味，不具备可食肉的特征。这样的肉从相对意义上讲不适于加工和烹调。,肉的成熟定义： 尸僵持续一定时间后，即开始缓解，肉的硬度降低，保水性有所恢复，使肉变得柔嫩多汁，具有良好的风味，最适于加工食用，这个变化过程即为肉的成熟。肉的成熟包括尸僵

12、的解除及在组织蛋白酶作用下进一步成熟的过程。 尸僵时肉的僵硬是肌纤维收缩的结果，可以认为成熟时又恢复伸长而变为柔软。,37,38,表1 肌肉中可能与肌原纤维和结缔组织的死后削弱有关的蛋白酶,（一）、钙离子激活中性蛋白酶,钙蛋白酶是一种降解蛋白的酶，主要是对肌肉各种蛋白的降解。calpain把肌原纤维中的蛋白进行降解，故而肌纤维被降解，骨骼肌的剪切力降低，肉的嫩度提高，是对肉的成熟嫩化起重要作用的一种倚赖钙离子的蛋白酶。 calpain活性受肌细胞中钙离子的浓度影响，钙离子可以激活此蛋白，根据激活此种蛋白所需的钙离子浓度calpain分为u-calpain（微摩尔级）和m-calpain（毫摩尔

13、级）。,39,（二）、肌肉组织蛋白酶,组织蛋白酶D：在pH5以下最有效，能够广泛降解肌原纤维蛋白，水解过程中释放的产物多为7-13个氨基酸残基组成的小肽。 组织蛋白酶B：分子质量为24-29KDa，能够水解肌动蛋白、肌球蛋白、肌钙蛋白和原肌球蛋白； 组织蛋白酶L：分子质量为25-29KDa，能够降解肌球蛋白重链、肌动蛋白、肌钙蛋白的T亚基和I亚基，兼有内肽酶和外肽酶的活性，是溶酶体酶中削弱肌原纤维方面最有效的。,40,二、碱性乳蛋白酶纤维蛋白酶（PL） 水解的最适条件：温度为37，pH为7.4-7.5 对乳制品的影响： 对干酪的影响 PL水解-、-CN生成- CN及多种胨等小片段，在一定程度上

14、可以有效促进干酪成熟和风味物质的产生，对某些新鲜干酪具有有利作用； 由于PL对酪蛋白的水解，破坏了乳蛋白的整体结构，使干酪组织状态变软，持水性差，而且有时由于水解不当，使干酪易带有苦味等不良风味，所以极大的影响着干酪的产量和品质。,41,对UHT乳的影响（凝胶现象） 乳蛋白的水解：纤维蛋白酶系和微生物蛋白酶是引起乳蛋白水解的主要因素。由于这些蛋白酶具有很强的耐热性，所以在UHT乳贮存一段时间后，乳中尚存的酶类水解乳蛋白，生成许多小的肽段； 生成的小肽段和其他成分发生一系列物理化学变化，并发生聚集，最终形成凝胶。,42,3.3 蛋白酶在食品加工中的应用,43,重要,44,3.3.1 蛋白质的酶水

15、解,一、蛋白酶来源 动物蛋白酶：胰蛋白酶、胃蛋白酶； 植物蛋白酶：木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶； 微生物蛋白酶：碱性蛋白酶、中性蛋白酶。,45,二、水解物的水解度 （1）水解程度,（2）水解度,46,三、蛋白酶水解物的功能性质的变化,溶解性质：酶水解提高了原蛋白的溶解性； 乳化性质：当水解度低时，肽的分子量较大，能增加乳化能力，当水解度较高时，分子量降低，乳化能力下降； 起泡性质：在水解度较低或中等情况下，蛋白水解物的起泡性增加； 黏度：和原蛋白比较，明显下降。,非限制性水解蛋白酶：是指酶的专一性很差，能水解蛋白质中的很多肽键，使生成各种小肽甚至游离氨基酸。 限制性水解蛋白酶：是指酶的专一性很强，只

16、作用于某一特定的蛋白质底物，水解其中特定的肽键，并随之产生各种具有不同生理功能的活性多肽或蛋白质。,47,四、蛋白酶水解物的应用,作为营养强化剂，应用于果汁饮料、运动饮料、强化饮料等食品中； 蛋白质的限制性酶水解 肉类嫩化 干酪制作 苦味肽脱苦 大豆蛋白的改性,48,49,50,51,3.3.2 转蛋白反应,转蛋白反应，又称类蛋白反应（Plastein reaction）是食品科学领域涉及蛋白质的一个重要反应，本质上是一个分两步进行的酶反应： 蛋白质的水解和蛋白质重新合成。,52,转蛋白反应的应用：,蛋白质水解物的脱苦 蛋白质生物效价的改善 新蛋白质资源的开发 蛋白质功能性质的改善,53,3.3.3 交联反应,蛋白质的交联反应：蛋白质分子间可以通过其侧链上的特定基团联结在一起形成更大的分子，从而使蛋白质变性。 转谷氨酰胺酶是目前食品工业中允许使用的一种蛋白质改性酶，通过催化蛋白质分子内、分子间的转酰基反应，在赖氨酸残基和谷氨酰胺残基间形成新的共