《丁酸钠对胶质母细胞瘤u251的放射增敏作用及其机制研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《丁酸钠对胶质母细胞瘤u251的放射增敏作用及其机制研究（41页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、华中科技大学 硕士学位论文 丁酸钠对胶质母细胞瘤U-251的放射增敏作用及其机制研究 姓名：李宇辉 申请学位级别：硕士 专业：肿瘤学 指导教师：伍钢;杨坤禹 20090501 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2 摘摘 要要 丁酸钠放射增敏胶质母细胞瘤丁酸钠放射增敏胶质母细胞瘤 U-251 的作用及其机制研究的作用及其机制研究 研究生 李宇辉 导师 伍 钢 杨坤禹 华中科技大学同济医学院附属协和医院肿瘤中心 【目的】观察组蛋白去乙酰化抑制剂丁酸钠对胶质母细胞瘤 U-251 放射增敏作用，并 探讨其对射线导致的 DNA 双链断裂修复过
2、程的影响以及这一过程中可能涉及的分子 机制。 【方法】MTT 法检测 NaB 对 U-251 的细胞毒性；克隆形成法观察 NaB 对 U-251 放射 敏感性的影响；采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）以及 Western-Blot 检测不同浓 度 NaB（05mmol/L）对胶质母细胞 U-251 的 Ku-70mRNA 及蛋白表达的影响；采用 免疫细胞化学法，检测 3mmol/LNaB 预处理过的 U-251 在受到总量为 2 Gy 的 X 线单 次照射后胞核内-H2AX 荧光焦点的动态变化特点。 【结果】NaB 对 U-251 的毒性呈剂量依赖性，IC50值约为 16mmol/L ；
3、3mmol/L （20%IC50）NaB 处理组细胞在受到不同剂量 X 线（0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy） 照射后细胞的存活率、 D0值和 Dq 值均少于单纯照射组 （P0.05） ， 放射增敏比 （SER） 为 1.23；NaB 作用于 U-251 后显著降低了细胞内 Ku70 的 mRNA 和蛋白表达水平 （P0.05） ；NaB 处理组细胞受 2 GyX 线照射后，于 0h、0.5h、8h 及 24h 各时间点检 测胞核内-H2AX 的荧光焦点数母分别为 2、60、28 和 13 个，均大于单纯照射组于 各相应时间点检测到的焦点数：0、42、16 和 2 个（P0.05） 。
4、【结论】 组蛋白去乙酰化抑制剂 NaB 可以通过抑制辐射后 DNA 双链断裂修复基因 Ku70 的表达，降低肿瘤细胞对 DNA 双链断裂的修复能力进而增加细胞放射敏感性。 【关键词】 丁酸钠,放射敏感性,Ku70,DNA 双链断裂,磷酸化组蛋白-H2AX 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 3 ABSTRACT Enhanced radiosensitivity of sodium butyrate on a glioma cell line U-251 and its possible mechanism Postgraduate
5、Li Yuhui Tutor Wu Gang Yang Kunyu Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology Objective To investigate enhanced radiosensitivity of a Histone deacetylase inhibitors(HDACi), sodium butyrate(NaB), on a glioma cell line (U-251) and explore its possible radiosen
6、sitizing mechanisms. Methods Increased radiosensitivity of NaB on U251 was detected by clonogenic cell survival assays. Influence of NaB on the expression of Ku70 mRNA and protein was detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot analysis. Radiation-induced -H
7、2AX foci were measured at different time points after radiation alone, and combined treatment with NaB and radiation. Result Cell survival rate was much lower after treatment with the combination of NaB and radiation than that of radiation alone, D0 and Dq value were decreased after after treatment
8、with the combination of NaB and radiation than that of radiation alone(D0 1.43 Gy vs 1.76Gy ；Dq 1.22 vs 2.05 Gy) , with SER being 1.23.Levels of Ku70 mRNA and protein were suppressed in U251 treated with NaB in a dose-dependent manner. The average number of -H2AX foci per cell in cultures receiving
9、the combined NaB/radiation treatment was 2、60、28 and 13 respectively, which was significantly higher than the radiation-only group, at the 30 minutes、2、8 and 24 hours time points(P0.95 的标准 曲线可用于测定样品。 0g 2.5g 5.0g 10.0g20.0g 40.0g 1mg/ml BSA 2.5l 5.0l 10.0l20.0l 40.0l 0.15mol/L NaCl 100l 97.5l95.0l90
10、.0l80.0l 60.0l G250 考马斯亮蓝溶液 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 3）蛋白定量：取足量的 1.5ml 离心管，每管加入 4储存的考马斯亮蓝溶液 1ml。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 17 室温放置 30min 后即可用于测蛋白。取一管考马斯亮蓝加 0.15mol/L NaCl 溶 液 100 l，混匀放置 2 分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准 曲线的程序下按 blank 测空白样品。弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯 2 次 （每次 0.5ml） ，再用无菌水洗一次。再取一管
11、考马斯亮蓝加 95 l 0.15mol/L NaCl 溶液和 5l 待测蛋白样品，混匀后静置 2min，倒入扣干的比色杯中按 sample 键测样品。 4SDS-PAGE 电泳 1）按前面方法配 10分离胶，加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可 用 10ml 枪吸取 5ml 胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后 胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。当水和胶之间有一条折射线时，说明胶 已凝了。再等 3min 使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。 2）配 4的浓缩胶,加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。 将剩余空间灌满浓缩胶然 后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要
12、使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。 插梳子时要使梳子保持水平。 由于胶凝固时体积会收缩减小， 从而使加样孔的 上样体积减小， 所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。 待到浓缩胶凝 固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。 3）用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。 （小玻璃板面向内，大玻璃板面向 外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。 ） 4）测完蛋白含量后，计算含 50g 蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至 0.5ml 离心管中，加入 5SDS 上样缓冲液至终浓度为 1。上样前要将样品 于沸水中煮 5min 使蛋白变性。 5）加足够的电泳液后开始
13、准备上样。 （电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。 ） 用微 量进样器贴壁吸取样品， 将样品吸出不要吸进气泡。 将加样器针头插至加样孔 中缓慢加入样品。 6）等电压电泳，浓缩胶电压为 50V，当跑过浓缩胶后，将电压调大到 90V，继续 电泳至溴酚蓝跑到凝胶底部。 5转膜 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 18 1）转一张膜需准备 6 张 7.08.3cm 的滤纸和 1 张 7.38.6cm 的硝酸纤维素膜。 切滤纸和膜时一定要戴手套， 因为手上的蛋白会污染膜。 将切好的硝酸纤维素 膜置于水上浸 2 h 才可使用。 （用镊子捏住膜的一边轻
14、轻置于有超纯水的平皿 里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜 浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。 ） 2）将夹子打开使黑的一面保持水平。 在上面垫一张海绵垫， 用玻棒来回擀几遍以 擀走里面的气泡。 （一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。 ） 在垫子上垫 三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上） ，一手固定滤纸一手用玻棒擀 去其中的气泡。 3）要先将玻璃板撬掉才可剥胶， 撬的时候动作要轻， 要在两个边上轻轻的反复撬。 撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻 刮去（浓缩胶影响操作） ，要避免把分离胶刮破
15、。小心剥下分离胶盖于滤纸上， 用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个 胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖 3 张滤纸并除去气泡。最后盖 上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的 擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。 （转移液含甲醇， 操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。 ） 4）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电 转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用 60V 转移 2 h 或 40V 转 移 3 h。 5）转完后将膜用 1丽春红染液染 5min（于脱色摇床上摇）
16、 。然后用水冲洗掉没 染上的染液就可看到膜上的蛋白。 将膜晾干备用。 6免疫反应 将膜用 TBS 从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上 摇动封闭 1h。将一抗用 TBST 稀释至适当浓度（在 1.5ml 离心管中） ；撕下适当大 小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体 溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 19 放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育 12h 后，用 TBST 在室温下脱色摇床上洗两次，每次 10min；再用 TBS 洗一次，10min。同上方法 准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育 12h 后，用 TBST 在室温下脱色摇床 上洗两次，每次 10min；再用 TBS 洗一次，10min，进行化学发光反应。 7化学发光、显影和定影 取化学发光剂鲁米诺 A
