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1、羔羊铜缺乏症的诊治 白东英李引乾刘晓强蒿彩菊 ( 1 西北农林科技失学动物科技学院陕西杨陵7 1 2 1 0 0 ； 2 河南科技大学动物科技学院河南洛阳4 7 1 0 0 3 ) 本试验主要从流行病学调布、临床症状观察、病理学变化以及微晕元素测定等几方面对 送检羔羊进行诊断。流行情况和临床表现士要为：牧氏从3 月上旬接羔开始有1 9 户陆续发 现羔羊不明病冈死亡，= i ：；的产下即为死羔，有的存活1 0 天左右死亡。发病牧区的草场有一 个共同点，即均为戈啦滩草场。母羊膘情较好，乳汁充足，发病羔羊一般体温不高，呼吸、 心跳正常，但人都比较消瘦，被毛凌乱，山现阵发性神经症状，后肢瘫痪，无法站立
2、，死前 多数有明显的抽搞现象。剖检变化：病死羔羊血液稀薄，凝I 舌1 不良。人脑组织出现不同料度 的水肿、软化，脑沟变浅，颅腔内有淡黄色液体。肝脏色泽不均、舯人、质地变脆。肾被膜 易剥离，切面皮质部吡管扩张，髓质颜色呼暗红。肺脏稍肿。脊髓内有黄色胶冻样物和少鼙 黄色液体。脐胱黏膜有少擐细小山血点。镜检可见脑纽织病变明显，除轻微水肿外，脑组织 不同隧域内均出现弥漫性或局灶性软化病灶。神经细胞不同程度的变性、坏死、溶解，神经 纤维山现断裂及脱髓鞘现象。脑组织内血管周嗣辨遍现明显空隙，附近缃织变疏松甚至 率网状。脊髓内出现弥敞性出血点，脊髓向质羊小脑髓质可见人小不等的空泡。输联管黏 膜层、I 卉l
3、有层都有不同科度出血：肾上腺皮质有人世弥漫性出血点。微量元素的测定：庹川 原子吸收光谱法测定了发病羔羊肝脏、羊毛干牧草中土要微肇元素含量。测定结果表明，羔 羊肿脏中铜的含世明罹低丁正常值( 正常值：2 0 - 1 0 0 m g & g ，测定平均值：0 4 9m g k g ) ，而 锌、钼含鼙则明显升高( 钼的l I ：常值2 - 4 m g k g ，测定平均值1 3 7 4 m g k g ，) 。特制是钼在羊毛 和牧草中的含苗也比止常值高得多( 羊毛中钼的测定平均值3 1 3 5 m g k g ，止常值4 - 2 6 m g k g ； 牧草中的测定甲均值6 4 6 7 m g k
4、 g ，正常值I - 3 m g k g ) 牧草中的测定平均值，并且病区牧草中 铜钳的比值远远低丁临界值( 2 ：1 ) 。从发病羔苷的流行病学、临床表现、病理变化，以及 微鼋元素测定和治疗试验等综合分析，该不明步匕冈羔羊患的是一种继发性铜缺乏症。 三种致泻性大肠埃希氏菌毒力基因多重P O R 检测方法的研究 李继昌，佟恒敏，张铁男，霍责成，刘宁 ( 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨1 5 0 0 3 0 ) 根据毒力闪子、致病机理及遗传特性，国际上将致泻性人肠埃希氏菌( E c o i l ) 分为肠 致病性E c o i l ( E P E C ) 、肠出血性E c o l i (
5、E H E C ) 、肠侵袭性E c o l i ( E I E C ) 、肠产毒性E c o l i ( E T E C ) 、肠集聚性E c o l i ( E A g g E C ) ，其中E T E C 菌株通过L T 平| Js T 致病基冈的作H J 引 1 0 4 起腹泻。E P E C 的致病性与L E E 毒力岛上的e a e A 毒力基因有戈。E I E C 的侵袭性是冈为在侵袭 性质粒上含有i p a H 毒素基冈。日前采I j 的检测食品中E c o i l 的分离培养法刚性率低，且费 时费力 P C R 技术为其快速检测提供了有力手段但目前尚无同时检测儿种腹泻致病菌的
6、方 法。本研究分别以S T 、e a e A 、i p a H 毒素基冈设计引物，应_ I J 多重P C R 同时扩增E P E C 、E I E C 和E T E C 的毒力基冈，以建立一种快速检测牛奶中致泻性E c o l i 的P C R 扩增方法。 根据G e n B a n k 上登陆的人肠杆菌致病基冈e a e A 、i p a H 和s T 的序列，利用O l i 9 0 4 0 软 什针对其保守区改计3 对引物，分别进行P C R 反席，采l 常规琼脂糖凝股电泳检矗P C R 产物， 并将其与p M D l 8 - - 1 8 TV e c e o r 连接，将重组质粒测序，
7、其结果与G e n B a n k 中报道的相关毒素基 序列进行同源性比较分析，判断P c R 产物的特异性。在不同退火温度，引物浓度、模板埴， 反鹿条件下进行多重P C R 反应条什的优化，并进行多重P C R 的特异性及灵敏度的测定，确定 最佳P C R 反应条什承体系。将牛奶中经分离培养、生化反应、血清学实验( E T E C 除外) 、动 物致病性实验确定的E c o i l 的分离凶株提取D N A ，进行多重P C R 反应。 实验结果表明，E T E C 、E P E C 和E I E C 标准曲株的单项P C R 扩增分别获得8 8 0 b p ( E P E Ce a e A
8、 ) 、 6 0 0 b p ( E I E Ci p a H ) 和1 5 0 b p ( E T E CS T ) 的扩增片段，与预期结果相同。经测序，e a e A 基 冈序列与西1 2 8 鲤5 4 2 k b I Q 笪2 2 ! ! I 的同源性为1 0 0 ； i p a H 片段序列与 g i l 2 4 0 8 0 7 8 9 1 9 b l A E 0 0 5 6 7 4 1 的同源性为9 9 ；S T 片段厅州与到1 4 8 Q 2 9 I 吐I M 2 2 2 5 5 ：! I 旦Q 工Q 嚣H S 的同源性为1 0 0 。经反麻条1 “ 1 ：优化筛选，确定P C R
9、 反席最佳体系丰条f l ：为1 0 P C Rb u f f e r5 O i t h1 0 m Md N T P l 0 p l ：2 5 m M M g C l 23O p l ；引物P 1 1 0 t t l ；引物P 2 1 O u l ： D N A 模扳5 O l a l ：T a q D N A 聚合酶( 5 U L I ) O 5 1 t t l 反麻总体积为5 0 O p l 。9 5 “ C5 m i n ，9 4 “ C4 0 S ， 5 1 3 “ C4 0 S ，7 2 l m i n 循环3 0 次，再7 2 延伸1 0 m i n 。在特异性试验中沙fJ 氏菌捡
10、测结果 阴性，表明其特异性良好。在多重P C R 反应中E P E c 、E I E C 、E T E C 的敏感性分别为3 ，8 7 4 2 3 、 3 6 0 5 1 9 、2 9 9 4 4 8 n g m l ( 4 3 1 0 3 、1 5 1 0 、2 6 1 0 C F U m 1 ) 。对牛奶中致泻性人肠杆菌致 病基冈的多重P C R 检测结聚为在确定的E c o l i 的分离菌株中，4 株0 m K “和2 株如：分 离菌中检测剑含有e u e A 毒素基冈，Q K m0 “b 并l 株分离菌中检测到含有i p a l 毒素基 冈，另有3 株分离菌中检测剑含有s T 毒素基
11、田。将生化反麻目f 性、血清学凝集反庶阴性， 引起小白鼠死亡的菌株暂定义为E c o l i 疑似菌，进行多重P C R 检测。将2 株E c o l i 疑似苗 恳液经小白鼠腹腔注射均在2 4 h 内北亡，提取D N A 进行多重P C R 反麻，发现1 株含有e a e A 毒素基冈。说明本法可检测剑诊断血清不能检测到的致泻性E c o l i ，检测率高丁普通培养 法。 总之，本方法与目前常H 】的分离培养法相比具有快速、检出率高、灵敏度高等优点但 因微生物本身的复杂性以及毒索基冈低拷贝性，使得多重P C R 方法检测有一定的局限性，需 进一步深入研究和发展其他方法，使牛奶中致泻性人肠杆菌快速检测日臻完善。
