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1、辽宁中医药大学 硕士学位论文 三组中药复方对大鼠肾小球系膜细胞MMP-3/TIMP-1表达影响的 实验研究 姓名：丁晓欢 申请学位级别：硕士 专业：中西医结合临床 指导教师：张君 20100301 辽宁中医药大学2 0 10 届硕士学位论文 摘要 目的： 从基因水平研究三组中药复方对肾小球系膜细胞基质金属蛋白酶( m a t r i xm e t a ll o p r o t e i n a s e s ，M M P S ) M M P 一3 及基质金属蛋白酶抑制物( t i s s u ei n h i b i t o ro fm e t a l l o p r o t e i n a s
2、e s ，T I M P S ) T I M P - l m R N A 表达的影响，对具有延缓和防治肾小球硬化进程的有 效药味探讨其作用机理。 材料与方法： 1 应用血清药理学方法，制取二组中药小复方及正常组的药理血清。 2 采用体外培养法培养大鼠肾小球系膜细胞。 ： 3 采用血毹：紧张素I I 作为刺激因了，作用于大鼠肾小球系膜细胞，使其发牛增殖。 4 应用E L I S A 法测定1 0 F B S 组及血饩；紧张素I I 组纤维连接蛋白( FN ) 、I V 型胶原的 含量。 5 采用逆转录- 聚合酶链反应技术( R T - P C R ) 观察各组间M M P 一3 及T I M P
3、 一1 的m R N A 的表达 情况。 结果： 1 血毹；紧张素I I 组F N 及型胶原的分泌量显著增加，同时与I O F B S 组相比有显著差异 ( P 原儿茶醛 原儿茶酸 丹参素 咖啡酸 迷迭 香宁酸n 0 5 1 。o 肾损伤和肾衰的影响：丹参对实验性家兔肾热缺血后近曲小箭上皮细 三组中药复方对大鼠肾小球系膜细胞I 删P - 3 T I M P - 1 表达影响的实验研究 胞具有保护作用，在阻断肾血流后6 0 和1 2 0 分钟，微绒毛和线粒体的缺血性损害减轻， 恢复血流3 0 分钟后，被损害的微绒毛和线粒体均基本恢复正常惦。对氨基核苷所致 实验性肾病大鼠，给予复方丹参注射液，其尿
4、蛋白总量下降，血浆蛋白、胆固醇、脂 质过氧化物含量有所降低，肾小球上皮异常、足突起肿大愈合、出现空泡的病理改变 也比对照组轻得多0 7 1 。由甘油引起家兔急性肾功衰竭，丹参注射液有增加肾血流量， 降低血尿素氮，增加肌酐清除率和尿量的作用唧。 白花蛇舌革，苦甘，性温，入心、肝、脾经。具有清热利湿消痈之功。泉州 本草载”清热散瘀，消痈解毒。治痈疽疮疡，瘰疬。又能清肺火，泻肺热。治 肺热喘促、嗽逆胸闷。实验研究证实，白花蛇舌革方剂治疗原发性肾小球肾炎表现 为肾病综合征，对于缩短患者疗程，减少复发疗效确切。实验性。肾炎有修复作用抑制免 疫细胞过减少免疫复合物的形成。其机制可能与活血化瘀药对抑制免疫，
5、抑制肾小球 纤维化，改善病人的高凝状态有关n 删。 紫草，入足少阴，凉血活血解毒。本革经疏“紫草为凉血之要药”。很多实验证 明，紫草有抑制病原微生物和抗炎作用，紫革的乙醚、水、乙醇提取物均有一定的抗 炎作用州。紫革醇提取物2 0 0 m g K g 灌胃给药对醋酸引起的小鼠腹腔渗出性炎症具有 明显的抑制作用。对大鼠皮内注射组织胺引起的血箭通透性亢进也有明显的抑制作 用，紫草水提取物有对抗两倍组织胺、4 9 倍马血清对家兔的致炎作用，能阻止组织胺 导致兔皮肤的毛细血符通透性增高，能预防家兔急性血清病2 j 。 益母革，入脾肾经，活血解毒祛瘀，性滑而利。本草求原“清热凉血解毒”，本 草汇言“行血养
6、血，行血而不伤新血，养血而不滞瘀血，诚为血家之圣药也”。实验 证实其丰要作用有：抑制血小板聚集及抗凝作用：体外实验，益母草乙醇提取物加 入大鼠血小板悬液中，明显对抗A D P 诱发的血小板聚集引。体内实验，大鼠静注益母 草制剂( 相当生药6 9 k g ) 对A D P 3 3 M G K G 诱发的血小板聚集也产牛明显抑制作用。 对血液粘滞性的影响：益母草注射液能显著降低家兔及高粘血症人的全血粘度，使 红细胞电泳时间、红细胞变形能力T K 值及红细胞聚集性明显降低聚集指数增高。对 肾功能的影响：益母草碱静脉注射明显增加麻醉家兔尿量。大鼠服用煎剂可见利尿作 用但其丰要作用可能系生药中所含钾盐引
7、起引。对狗缺血型急性肾衰模型，于肾衰后 6 小时及卜5 天，每天静注益母草2 0 m l ( 相当生药6 0 9 ) 显示良好的治疗效果，除肌 酐外，尿素氮、滤过钠排泄分数、肾血流量明显改善，肾功能较快恢复正常。 白茅根，凉血止血、清热利尿。本经“主劳伤虚赢，补中益气，除瘀血，血闭 辽宁中医药大学2 0 1 0 届硕士学位论文 寒热，利小便”。本革正义“寒凉而味甚甘，能清血分之热，而不伤于燥，又不粘腻， 故凉血而不虑其积瘀”。有实验证实，白茅根有止血、利尿作用，白茅根粉能明显缩短 兔血浆复钙时间。白茅根煎剂和水浸剂灌胃，对正常兔有利尿作用 1 1 7 o 给药5 - 1 0 天时，利尿作用最明
8、显，认为其作用与神经系统有关。 小蓟，甘凉，凉血止血、祛瘀解毒，本革拾遗“破宿血，止新血”。研究表明小 蓟有止血作用，可使出血时间明显缩短，止血的有效成分是绿缘酸和咖啡因引。 9 、小结 近年来，虽很多研究发现中药可经由多种途径延缓和防治肾小球硬化。然将以上 三组由三昧中药组成小复方从分予生物学和血清药理学角度探讨中药小复方缓解肾小 球硬化的作用机理尚无文献报道，本研究结果表明，复方1 号组有显著的促进M M P 一3 基因表达的作用，从而延缓和防治肾小球硬化。其中高中低三个剂量组无量效关系， 也体现了临床用量的合理性，对于需长期服药的患者是安全有效的。同时，复方2 号 组与复方3 号组对M
9、M P - 3 的基因表达有促进趋势，说明其对M M P 一3 基因表达有不同程 度的促进作用，与抑制E C M 合成，促进其降解关系密切。另外，三组小复方对T I M P 一1 的基因表达无统计学意义，原因可能为肾小球硬化发牛发展过程是多种因素参与的十 分复杂的过程n 1 9 2 ，药物间有效成分不尽相同，具体通过哪些途径延缓肾小球硬化的 过程还有待于进一步研究。本研究以多年临床治疗肾小球疾病的中医用药经验为基础， 不仅为小复方的临床应用添加了理论依据，也为小复方药物有效成分的更深入研究及 活性部位的进一步确定奠定了一定的基础。 三组中药复方对大鼠肾小球系膜细胞P 一3 T I M P 一1
10、 表达影响的实验研究 结论 1 复方1 号组有显著的促进M M P 一3 基因表达的作用。 2 复方1 号组通过促进M M P 一3 的基因表达，从而发挥延缓和防治肾小球硬化的作用。 3 复方2 号组与复方3 号组对M M P 一3 的基因表达有促进趋势。 辽宁中医药大学2 0 10 届硕士学位论文 附图 I _ 囊j | |誊一- “ 一 图1 ：倒置显微镜下复苏后的肾小球系膜 细胞 图3 由左至右分别为正常 组、A n gI I 组、复方1 号高 中低剂量组删P 一3R T P C R 电泳条带 f j ”“” 。 i1 ；| ； 二j i 。 i 一，? _ 二 | _ l 。1 ：!
11、；。t：| 磐誓 E n一； 爱i 蔓著鬟 l 。j 。i - j 。 j i 季。j 薹萋j 囊 图2 ：倒置显微镜下细胞融合1 0 0 待 传代的肾小球系膜细胞 图4 由左至右分别为正常 组、A n gI I 组、复方2 号高 中低剂量组M M P - 3R T - P C R 电泳条带 图5 由左至右分别为正常 组、A n gI I 组、复方3 号高 中低剂量组M M P 一3R T P C R 电泳条带 三组中药复方对大鼠肾小球系膜细胞I m d P - 3 T I M P I 表达影响的实验研究 图6 由左至右分别为正常 组、A n gI I 组、复方1 号高 中低剂量组T I M
12、P 一1 R I 、- P C R 电泳条带 图7 由左至右分别为正常 组、A n gl I 组、复方2 号高 中低剂量组T I M P 一1 R T - P C R 电泳条带 图8 由左至右分别为正常 组、A n gl I 组、复方3 号高 中低剂量组T I M P 一1R T P C R 电泳条带 辽宁中医药大学2 0 10 届硕士学位论文 参考文献 1 E 1N a h a sA M G l o m e r u l o s c l e r o s i s ：i n t r i n s i ca n de x t r i n s i cp a t h w a y s ( J ) N e p
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16、s s u e g r o w t hf a c t o ra c t i v i t yi nc u l t u r e dr a tm e s a n g i a lc e l l sa n di t se x p r e s s i o ni n e x p e r i m e n t a ld i a b e t i c9 1 0 m e r u l o s c l e r o s i s ( J ) J A mS o cN e p h r o l ，2 0 0 0J a n ； 1 1 ( 1 ) ：2 5 3 8 1 0 B o r d e rW A ，N o b l eN A ，K e t t e l e rM 。T G F 一1 3 ：ac y t o k i n em e d i a t o r
