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1、5.5 电泳,A SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 使用含有十二烷基硫酸钠（ SDS）和还原剂（通常为巯基乙醇）的样品处理液对蛋白质样品进行处理（一般煮沸35分钟），通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。同时还原剂可以切断蛋白质中的二硫键（使二硫键还原）。 经过这样处理的样品中的肽链都是处于无二硫键连接的，分离的状态。由于SDS是带有负电荷的分子，同时它有一个长的疏水尾巴，SDS通过疏水尾巴与肽链中的氨基酸的疏水侧链结合，结合SDS的比率大约是一个蛋白质分子中每两个氨基酸残基结合一分子的SDS。,垂直板电泳装置,加样,样品迁移方向,电泳过程中分子迁移的
2、规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。,混合样品,带孔胶,按分子大小分离,电泳方向,电泳,小分子,大分子,夹在两块玻璃板之间的凝胶,电泳缓冲液,电泳缓冲液,加在槽中的经SDS处理的样品,分子量小,分子量大,电源,电泳后的凝胶径考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片,标准蛋白分子量,未知蛋白,在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量。,相对迁移率,水平式电泳装置,电泳缓冲液,凝胶,B 等电聚焦电泳（ IFE） 利用聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液在电场作用下沿电场方向在凝胶内制造一个pH梯度。 每种蛋白质都
3、将迁移至与它的pI 相一致的pH处。,凝胶中加有两性电解质溶液（pH9-3）,加电场后在凝胶内形成一个稳定pH梯度,加样品，然后继续电泳,凝胶染色表明样品按照各自pI值沿着pH梯度分布,等电聚焦电泳进行过程中,等电聚焦电泳结束后,（）,（）,（）,（）,高pH,高pH,低pH,低pH,C 双向电泳 第一向：等电聚焦电泳第二向：SDS-PAGE 双向电泳后的凝胶经染色后蛋白呈现二维分布图： 水平方向反映出蛋白在pI上的差异， 垂直方向反映出它们在分子量上的差别。,第一向电泳：等电聚焦电泳,聚焦后凝胶放置在SDS凝胶上，进行第二向电泳,第二向电泳：SDS-PAGE,分子量大,分子量小,pH9,pH
4、3,pH9,pH3,大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳凝胶染色后照片,等电聚焦电泳进行过程中,等电聚焦电泳结束后,（）,（）,（）,（）,高pH,高pH,低pH,低pH,组织匀浆,硫酸铵分级,离子交换,凝胶过滤,亲和层析,一种目的蛋白经五个纯化步骤（分别取样）的凝胶电泳图,5.5蛋白质的氨基酸序列确定 每一种蛋白质都具有唯一的氨基酸序列。实际上蛋白质的氨基酸序列是由DNA决定的。,一级结构,二级结构,三级结构,四级结构,A. 蛋白质的氨基酸组成的定量确定 酸水解：破坏蛋白质的肽键 柱层析：进行氨基酸定量分析，每个氨基酸的量与洗脱峰 的面积成比例。,B. Edman降解方法常用于氨基酸序列的测定,第一
5、轮降解,第二轮降解,PTH丙氨酸,少了一个氨基酸残基的肽,C. 大蛋白被水解成肽段后再测序 Edman降解法测序一次只能连续降解几十个氨基酸残基。要测定大的蛋白质的氨基酸序列，需要将蛋白质降解为一些肽段，然后再进行Edman降解测序。 溴化氰（BrCN）：可以特异与蛋白质中的蛋氨酸残基反应 生成一个C末端为高丝氨酸内酯的肽和一个带有新的N 末端残基的肽。 胰蛋白酶：特异地催化赖氨酸（Lys）残基和精氨酸（Arg） 残基羧基侧的肽键的水解， 胰凝乳蛋白酶：特异地催化苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸 （Tyr）和色氨酸（Trp）三种芳香族氨基酸残基羧基一 侧的肽键水解。,胰蛋白酶作用,胰凝乳蛋白酶作用,
6、拼出完整氨基酸序列,将蛋白质水解为氨基酸，测组成,确定N和 C端氨基酸,确定小肽段氨基酸序列,确定小肽段氨基酸序列,利用两组不同肽段序列确定完整氨基酸序列,氨基酸序列确定过程,要点归纳,1. 可以根据各种蛋白质的溶解度、电荷、大小以及结合特性上的差异，从生物资源中纯化蛋白质。常用的方法包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、SDS-PAGE、等电聚焦和双向电泳等方法。 2. 离子交换层析层析分离蛋白质主要取决于各种蛋白质所带净电荷，分为阳离子和阴离子交换层析。在进行离子交换层析时，时刻要想到这样的原则：处于等电点（pI）的蛋白质所带净电荷为零；当蛋白质所处溶液pH pI时，该蛋白质带负电荷，
7、如果pH pI时，蛋白质带正电荷。,3. 凝胶过滤层析是按照蛋白质分子大小进行分离的。根据使用的凝胶排阻分子量不同可以分离分子量范围不同的蛋白质。 在凝胶容许分离的分子量范围内，蛋白质分子量对数与洗脱体积成比例，所以可以根据标准蛋白质曲线求出未知蛋白质的分子量。 要注意是整个蛋白质分子量，而不是亚基（即构成寡聚蛋白的多肽链）的分子量，而SDS-PAGE求出的是亚基（肽链）的分子量。蛋白质质量的精确测定可以通过沉降平衡测定或质谱确定。,4.亲和层析取决于分离蛋白与配体的亲和程度。配体都是通过共价键与载体（树脂或葡聚糖凝胶）结合，配体可以是酶底物、抑制剂、抗体（或抗原）或其他特异识别要纯化的目的蛋
8、白等的分子（或基团）。 5. SDS-PAGE是在变性条件下进行的电泳，SDS按照一定比例（1克蛋白结合1.4克SDS）通过疏水相互作用与蛋白质结合，由于SDS为十二烷基硫酸钠，一端为疏水尾部，另一端带负电荷，所以掩盖了原有蛋白质所带电荷，因此SDS-PAGE大致按照肽链大小进行分离。 在一定凝胶（指分离胶）浓度范围内，蛋白质（肽链）分子量对数与蛋白质（肽链）的相对迁移率成直线关系，所以利用一组标准蛋白同时与未知蛋白一起电泳，通过标准蛋白的标准曲线可以求出未知蛋白的分子量。,6.等电聚焦则是在一个pH梯度凝胶中根据蛋白质等电点进行分离的。 7.双向电泳是等电聚焦电泳与SDS-PAGE组合的电泳
9、，通常第一向为等电聚焦电泳，第二向为SDS-PAGE。最后得到的电泳图谱是二维图象。 8. 一个蛋白质的组成可以通过在6N HCl、110条件下水解成其构件分子氨基酸来确定。水解生成的氨基酸通过离子交换层析进行分离，然后分离的氨基酸再与茚三酮等试剂反应进行定量。,9. 多肽的氨基酸序列可以通过Edman降解确定，测定使用的是与N末端氨基酸残基的氨基反应的异硫氰酸苯酯（PITC，也称之为Edman试剂）。PITC与末端氨基反应经环化等最后形成PTH氨基酸，每一轮都是从肽的N末端除去一个氨基酸。自动重复Edman降解测序仪可以分析大约50个氨基酸残基的序列。 10. 长的多肽链的序列利用蛋白酶和化
10、学试剂有选择地水解为小的肽段，再通过Edman降解测序，然后通过比较两套或几套有交叉重叠的肽段的氨基酸序列，推测出整个多肽链的氨基酸序列。,11. CNBr特异切断Met羧基侧的肽健，切断后的Met变成高丝氨酸内酯。胰蛋白酶特异作用于Arg和Lys羧基侧的肽健；胰凝乳蛋白酶特异作用于Phe、Tyr和Trp羧基侧肽健。另外羧肽酶从肽段或蛋白质的C末端逐一水解氨基酸残基。 12. 肽可以化学合成，分为液相合成法和固相合成法。液相合成法中肽链的生长是从N端向C端方向；而固相合成法肽链延伸是从C端向N端方向。现在常用的是固相合成法，在该方法中生长着的肽链的羧基端与固相载体连接，要整合到肽链上的氨基酸的-羧基被N,N-二环己基碳二亚胺（DCC）激活，并与生长着的肽链的-氨基结合，使肽链延伸一个氨基酸。,
