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1、中南大学 硕士学位论文 丁苯酞对Alzheimer病模型大鼠海马S100表达的影响 姓名：万顺 申请学位级别：硕士 专业：神经病学 指导教师：侯德仁 20090501 硕十学位论文中文摘要 摘要 目的：探讨A l z h e i m e r 病模型大鼠海马星形胶质细胞中S 1 0 0 表达及丁 苯酞对其影响和意义。 方法：成年雄性S D 大鼠6 0 只，随机分为模型组、丁苯酞组及对照组， 每组2 0 只，应用海马内注射a1 3 ，建立A l z h e i m e r 病模型，喂养6 0 天后取 大鼠脑组织，行S 1 0 0 免疫组化染色。 结果：与对照组比较，模型组大鼠海马各区S 1 0 0
2、 阳性细胞均明显增多， 差异有非常显著性( P 6 5 岁老年人群中A D 患病率为3 5 【1 2 1 。A D 病 理学改变是老年斑、神经元纤维缠结、广泛而程度不一的脑萎缩以及神经元和突触的缺 失。这些改变主要发生在海马和新皮质( 联络区) 【3 1 。 据报道A D 的发病机制可能与以下因素有关：1 遗传因素：A D 虽不是遗传性疾病， 但大量显示A D 的发病可能存在遗传易感性。目前研究发现前体蛋白基因、早老素基因、 载脂蛋白E 基因、T a u 蛋白基因可能参与A D 的发生发展。2 炎症因子的作用机制：研究表 明，A D 的发生和发展伴随着慢性炎症过程，这些炎症反应可对脑组织产生损
3、伤作用， 其中小胶质细胞和星形胶质细胞起重要作用。小胶质细胞作为中枢神经系统内的免疫细 胞，成为了神经炎症反应中的病因之一。A D 患者脑内存在丰富的被激活的小胶质细胞， 可产生过多的过氧化物、谷氨酸及一氧化氮，具有潜在的神经毒性作用f 4 】。已证实AB 的神经毒性作用是被激活的小胶质细胞所释放的活性氧所引起的，同时激活的小胶质细 胞和AB 可表达T N F a ，后者可致神经元损伤。 S 1 0 0 蛋白是一组低分子量的钙结合蛋白，大量研究表明S 1 0 0 蛋白与A D 的发展密切 相关，S 1 0 0 蛋白对细胞功能的调节作用依赖于浓度水平：低浓度神经营养和保护作用， 高浓度可引起神经
4、元变性和诱导细胞凋亡【5 1 。S l o o 在A D 的神经组织损伤中的作用目前尚 不明确。其损伤机制可能为：诱导细胞内钙超载，造成细胞水肿和损伤，或诱导星形胶 质细胞表达一氧化氮合酶，通过一氧化氮和氧自由基损伤细胞。另发现S 1O O 蛋白可导致 A D 神经突触无意义的过度延伸，后者足早期神经炎性斑块形成的关键因素，该发现亦 可能与S 1O O 所致的神经组织损伤有关。 本实验通过建立A D 模型，枪测其海马星形胶质细胞中S l O O 的表达及丁苯酞对其表 达的影响和意义，为探讨A D 的发病机制及寻找有效的治疗药物提供理论依据。 硕士学位论文第一章实验材料和方法 1 1 实验材料
5、第一章实验材料和方法 1 1 1 实验动物与用品 1 成年S D 雄性大鼠6 0 只，体重2 2 0 - - , 2 4 0 9 ：由中南大学湘雅医学院实验动物中一t l , 提供。 2 丁苯酞：石药集团恩必普药业有限公司，国药准字H 2 0 0 5 0 2 9 9 ，产品批号：0 6 11 0 2 ， 每O 1 9 溶于1 2 5 m l 食用麻油中，配成混悬液，4 “ C 冰箱保存备用，用前摇匀。 1 1 2 实验试剂 试剂名称 Ap1 4 2 兔抗大鼠S 1 0 0 多克隆抗体 A B C 免疫组化染色试剂盒 D A B 显色试剂盒 1 0 水合氯醛 多聚甲醛 P B S 粉 生理盐水
6、蒸馏水 中性树胶 二甲苯 无水乙醇 F 丁醇 异丁醇 苏木素、伊红 1 1 3 实验仪器 仪器私称 立体定位仪 生产商 美国S i g m a 公司 武汉博士德公司 v e c t o r V e c t o r 湘雅制药有限公司 天津市博迪化工有限公司 武汉博士德公司 湖南汇虹有限公司 中南大学湘雅三医院中心实验室 上海华申康复器材有限公司 湖南汇虹有限公司 湖南汇虹有限公司 湖南汇虹有限公司 湖南汇虹有限公司 江两德成制药有限公司 生产商 硕士学位论文第一章实验材料和方法 Y 型电迷宫 石蜡切片机 显微镜及图像分析系统 - - 2 0 冰箱 恒温箱 蒸馏水机 1 2 实验方法 根据参考文献
7、自行制作 美国A O 公司 日本尼康公司 容声电器有限公司 长沙仪器仪表厂 上海亚荣医疗器械有限公司 1 2 1 动物的筛选分组及行为学检测 Y - 形电迷宫试验箱参考文献【6 】自行制备，规定大鼠受电击后从起步区直接跳至安全 区为“正确反应”，所需的电击次数表示其学习记忆的获得能力。将大鼠放入Y - 迷宫箱 中，适应5 分钟，使其熟悉Y - 迷宫箱的三个臂的内部结构，然后从一个臂开始随机测试， 给3 0 一7 0 V 电流0 5 0 7 m A ，电击后大鼠逃避至安全区为正确反应，否则为错误反应。每 测一次休息3 0 秒，测10 次休息5 分钟。大鼠学习记忆能力以连续l O 次测试中有9 次
8、为 F 确反应时，所需的电击次数表示。数值越小，表示大鼠的学习记忆能力越好；数值越 大，表示大鼠的学习记忆能力越差。3 0 次中没有连续9 次正确的S D 大鼠被淘汰，共筛 选出6 0 只S D 大鼠，再将这6 0 只S D 大鼠随机分为模型组、丁苯酞组、对照组，每组 各2 0 只。 三组大鼠建模前和建模后6 0 天用Y - 形电迷宫试验箱对大鼠进行行为学习记忆能力 检测。 1 2 2AB 的孵育 未经处理的A1 31 4 2 为粉未状态，先将5 0 0 l ag A1 31 4 2 溶于1 0 N H 4 0 H 3 5ul 中， 离一1 1 , 机上混匀，加入2 1 5ul 无菌生理盐水充
9、分混匀，3 7 。C 恒温孵育箱中孵育1 周，使 其达至0 “老化”状态。 1 2 3 模型的制备 将S D 人鼠用1 0 水合氯醛( O 3 5m g k g ) 麻醉后置二j 二立体定位仪上，切丌皮肤，找 到I j 订囟所在化置，参考大鼠图谱和相关文献确定自订肉后3 3 m m ，中线左侧旁2 0 m m 为海 马所在的体表投影位胃，以牙科钻钻丌一骨窗，将微量妻i - 射器固定在立体定f 讧仪上，进 针约2 8m m ，模J 诬组和j - 苯酞绢缓慢均匀注入A1 31 4 25u1 ，对照组注入5ul 尤菌牛理 能水，5 分钟注射完毕，锌f 针5 分钟，然后缓慢撤针，术后缝合皮肤。 1 2
10、 4 动物的饲养 3 硕士学位论文第一章实验材料和方法 模型制备成功后三组大鼠均予以常规饮食及正常活动，丁苯酞组灌胃液为丁苯酞溶 液，按8 0 m g k g 剂量灌胃，模型组与对照组给予相应体积的食用麻油，均为每日两次， 每次1m l 1 0 0 9 ，连续6 0 天。 1 2 5 脑组织切片的制备 模型建立后6 0 天，将模型组、丁苯酞组和对照组三组大鼠用l O 水合氯醛( 0 3 5 m g k g ) 麻醉，暴露心脏，经左心室灌注O 9 的生理盐水，待大鼠的肝脏颜色变浅，然 后以4 的多聚甲醛灌注约3 0 分钟，1 0 m l 每分钟，取脑组织置于4 多聚甲醛溶液中冰 箱固定2 4 h
11、 ，0 0 1 M 的磷酸缓冲液反复浸沈，最后将脑组织梯度酒精脱水，透明，石蜡 包埋。所有标本均以注射点为中心做连续冠状切片( 厚约5l am ) 备用。 1 2 6H E 染色 染色方法：( 1 ) 切片在二甲苯中脱蜡两次，每次5 分钟。( 2 ) 入1 0 0 、9 5 、8 5 、7 0 酒精，各级为3 分钟。最后经蒸馏水转入染液。( 3 ) 苏木精染液染色5 分钟。 ( 4 ) 流水冲洗1 5 分钟。( 5 ) 0 5 伊红染液染色1 5 秒。( 6 ) 流水冲洗2 0 分钟。( 7 ) 依 次经7 0 、8 5 、9 5 、1 0 0 酒精脱水，各级为3 分钟。( 8 ) 二甲苯透明
12、( 二次) ，共 约l O 分钟。( 9 ) 封片：擦去切片周围多余二甲苯，切勿干涸，迅速滴加适量中性树胶， 再加盖玻片封固。 阳性细胞计数：普通光学显微镜下观察大鼠海马神经元形态，计数2 0 0X 视野下海 马C A l 区神经细胞的个数，计算C A I 区神经细胞的密度，神经细胞密度( 个m m ) = 海 马C A l 区正常神经细胞数C A l 区长度。其中以细胞出现浓染、核固缩、核破碎为坏死 或凋亡的神经细胞，不列入计数范围内。每组每只大鼠观察2 张切片，取其平均值作为 该只大鼠C A l 区神经细胞密度的最终值。 1 2 7 免疫组织化学主要试剂和实验方法 染色方法：取脱蜡切片入P
13、 B S 缓冲液，经抗原修复液( 美困V e c t o r , H 3 3 0 0 ) 8 0 0 C 存 放2 0 m i n ，缓冲液清沈2 次，再入0 3 H 2 0 2 室温2 0 m i n ，以消除内源性过氧化物酶。然 后，切片孵育在2 小牛血清中1 小时，以减少非特异性反应。实验巾所用抗体S 1 0 0 1 3 ( 购于武汉博士德，产品编号：B M 0 1 2 0 ) 。切片在S 1 0 0 ( 1 ：2 0 0 ) 抗体巾孵育4 0 C 过夜， 次n 经缓冲液洗涤3 次后，加相应二二抗( 1 ：4 0 0 ) 溶液，室温孵育l 小时，缓冲液沈涤3 次后，加生物素与卵白素结含(
14、 A B C ) 试剂盒配置的混合液巾培育l h r 。底物呈色反应剂采 用D A B 。所有二抗、A B C 和D A B 试剂盒购自荚国v e c t o r 公司。旱色反J 够后，切片经逐 级脱水并封片。 阳性细胞计数方法：无论染色深浅，J l 婴所示细胞的呈色为D A B 特征，阽褐色染色， 存低倍和高倍镜- 卜与背景I 遁分明确，睦f J 认为是S 1 0 0 免疫反J 虹附队细胞。对2 0 ( j 镜倍 4 硕十学位论文第一章实验材料和方法 率) x 1 0 ( 物镜倍率) 下所采集图像进行阳性细胞计数，每只大鼠计数5 张切片，用阳 性细胞平均数进行统计分析。 1 2 8 统计分析
15、 在日本产N i k o nE c l i p s e8 0 i 显微镜下观察结果，并用N i k o nD S 高分辨率数码像机经 N I S E l e m e n t sA R3 0 软件拍照。对脑组织切片均通过拍照收集全海马切面图像。结果分 析，采用V e r 3 0 0 程序软件作图像数字采集，并采用S P S S1 5f o rw i n d o w s 软件进行数据 分析，各组间比较采用单因素的方差分析( A N O V A ) ，组问两两比较采用最小显著差异 t 检验( L S D t 检验) ，检验水准：a = 0 0 5 。 硕士学位论文第二章实验结果 第二章实验结果 弟一
16、早 哭短至西禾 2 1 行为学评价结果 各组大鼠在术前行为难常，术后均出现精神萎靡、反应迟钝、少食、少饮。术后1 天，对照组精神恢复：余组改善不明显，可能与A1 3 所致脑部损伤有关。3 - - 5 天后逐渐 恢复，1 周后基本正常，体重恢复，伤口逐渐愈合。灌服丁苯酞干预后，丁苯酞组大鼠 行为学较模型组明显改善。 以大鼠币确逃避电刺激所需的电击次数表示其学习记忆能力，所需次数越少，说明大 鼠的学习记忆能力越好；反之，所需次数越多，说明其学习记忆能力越差。术前各组间 比较，F - - 0 0 4 1 ，P 0 0 5 ，无统计学意义，说明手术前各组大鼠币确逃避电刺激所需的 电击次数无差别。造模及干预后6 0 天再次进行行为学检测，各组问比较，F = 1 1 6 8 2 ， P 6 5 岁老年人群中A D 患病率为3 5 。根据 我国第五次入口普查公布的数字估计6 5 岁以上年龄段A D 患
