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1、一种高灵敏度的时间分辨荧光免疫分析仪的临床应用一种高灵敏度的时间分辨荧光免疫分析仪的临床应用 郭周义郭周义 田振 田振 (华南师范大学激光生命科学研究所,广州 510631,E-mail:ann ) 摘 要：摘 要：时间分辨荧光免疫分析技术是当前临床检验领域一种高灵敏度的定量检测技术，它与 其它标记免疫分析技术的区别，是用稀土元素及其螯合物作为示踪剂，代替普通的荧光素、 同位素或酶等，来标记蛋白质、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞。时间分辨荧光免疫 分析仪根据稀土元素荧光半衰期长、Stokes 位移大的特点，用短脉宽的紫外脉冲光激发后， 利用时间分辨技术和光谱分辨技术，消除了散射光、短寿命杂
2、散荧光等背景光对检测极限的 限制，大大提高了检测的灵敏度。本文依据 NCCLS 的临床评价理论制订了一套经济适用的 临床实验方案，并根据该方案对自行研制的采用高频脉冲氙灯做激发光源的时间分辨荧光免 疫分析仪的临床应用性能进行了检验。将待检验的分析仪的测试结果与公认的常规方法得到 的测试结果比较，经相关回归分析所得出的相关系数都在 99.5%以上，显著性检验小于 0.01。 关键词：关键词：时间分辨荧光免疫检测； 时间分辨技术；光谱分辨技术 Clinic Applications of A Sensitive Time-resolved Fluorescence Immunoassay Inst
3、rument GUO Zhou-yi， TIAN Zhen (.Institute of Laser Life Science, South China Normal University, Guangzhou, 510631,China) Abstract: Time-resolved fluorescence immunoassay(TRFIA) is a sensitive ration detection technique. It differs from other labeled immunoassay is that it uses lanthanide trivalence
4、ion and its chelates for marking substance, instead of isotopes, enzyme, and other fluorescence substance. Basing on the fluorescence peculiarity of lanthanon such as long lifetime and big Stokes displacement, time-resolved fluorometer uses pulsed-light to excite the samples and avoids the detection
5、 limitation comes from dispersion and mixed fluorescence with the use of time-resolved and spectra-resolved technique, it can be highly sensitive. In this text, a applicable clinic experiment scheme depending on the clinic experiment theory of NCCLS was reported. Then, a time-resolved fluorometer wh
6、ich uses pulsed-light Xenon lamp to excite samples was detected. Comparing the test result of ours with the result of the normal method, their correlation quotiety was above 99.5%, prominence detection is under 0.01. Keywords: time-resolved fluorescence immunoassay(TRFIA) ， time-resolved technique ，
7、 spectra-resolved technique 1 引言引言 时间分辨荧光免疫分析技术123是当前临床检验领域一种很有前途的检验技术。由于采 用稀土离子及其螯合物作为示踪物，利用稀土元素荧光半衰期长、Stokes 位移大的特点，采 用时间分辨技术和光谱分辨技术，消除了散射光和短寿命杂散荧光的干扰，使其在灵敏度、 特异性、稳定性等方面都可与放射免疫分析法(RIA)相媲美，而且标记物制备简便、储存时间 长、无放射性污染、应用范围广。时间分辨荧光免疫分析仪是进行时间分辨荧光免疫分析的 必备仪器，其性能直接决定着所能达到的灵敏度。目前，大多数时间分辨荧光免疫分析仪采 用氮分子激光器作为激发光源
8、45， 我们在研究了稀土元素铕离子及其螯合物荧光光谱的基础 上6，研制了一种采用高频脉冲氙灯做激发光源7的时间分辨荧光免疫分析仪。为了检验该测 试仪的临床应用性能，本文根据美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS）制订的临床评 价方案8，选择目前在临床检验中广泛应用的 Perkin Elmer Life Sciences 公司的 AutoDELFIA 1235 全自动时间分辨荧光免疫分析仪，作为公认的常规方法，将本装置的测量结果与比较 方法的测量结果进行比较，用以评价本测试仪临床应用性能。 基金项目: 广东省重点科技攻关项目(2002C60113); 广州市天河区科技局重点攻关项目(2002
9、XGP06); 广东省自然科学基金项目(No.031518 教育部科学技术研究重点项目(No.02113). 2 实验实验 2.1 仪器设备 2.1 仪器设备 待检验的时间分辨荧光免疫分析仪由本课题组自行设计研制，其系统框图如图 1 所示。 对比仪器采用Perkin Elmer Life Sciences公司的AutoDELFIA1235全自动时间分辨荧光免疫 分析仪。 图 1 仪器结构方框图 Fig1 Functional Block Diagram of the Set 2.2 材料与方法材料与方法 所测项目选择临床标本量较大的胰岛素（insulin ,Ins）和 C 肽（C-peptid
10、e） ，采集一般门 诊与住院血样分离血清标本。 试剂采用 AutoDELFIA1235 的专用试剂盒。包括包被反应板、标准品、铕标记物、增 强液、稀释液、浓缩洗液等。 为减少人为因素的影响，标准品和样品的加样、孵育等预处理过程在全自动的 AutoDELFIA1235 上完成，它的过程为： AutoDELFIA1235 对待测样品将自动完成计数、分析、出分析结果的全过程后，将相 应的样品放到我们的待检验机上进行测试，将测试结果进行对比。 3 结果 结果 胰岛素（insulin ,Ins）和 C 肽（C-peptide）同一组样品分别在 AutoDELFIA1235 和待检 验机上的测试结果如图
11、27 所示。 3.1 胰岛素胰岛素 共检测 134 例标本。将标本分别在 AutoDELFIA1235 和待检验机上测试浓度，两组测 试结果作相关曲线如图 2 所示，经数理统计分析的线性回归方程如图 3 所示： 加血样 加标准品 加铕标记物 孵育洗板加增强液孵育 待测 LIGHT PRINTER POWER SUPPLE COMPUTER SCM PMT AND PRE-TRANSACTO RECEVING SAMPLE AND ITS EXCITING 020406080100120140 -20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Y samples concent
12、ration X testing times ours AutoDELFIA- 1235 图 2 胰岛素测试结果相关性曲线 Fig 2 Pertinence of the insulin test 0 20 40 60 80 100 120 050100150 AutoD ELFIA-1235 ours set 图 3 胰岛素测试结果线性回归曲线 Fig 3 Linearity Regress Currve of the Insulin Test 由图 2 可以看出，两台测试仪的测试结果非常一致。 图 3 所示的线性回归方程为： y = 1.0153x + 0.1552 相关系数为： r2=0
13、.9955，r=0.9977 显著性检验： P0.01 可见，两组数据的相关性很好。 3.2 C 肽3.2 C 肽 共检测 89 个标本。将标本分别在 AutoDELFIA1235 和待检验机上的测试，两组测试结 果作相关曲线如图 4 所示，经数理统计分析的线性回归方程如图 5 所示： 020406080100 0 2000 4000 6000 8000 10000 Y samples concentration X testing times ours set AutoDELFIA- 1235 图 4 C肽测试结果相关性曲线 Fig4 Pertinence of the C-peptide
14、test 0 2000 4000 6000 8000 10000 0.02000.0 4000.0 6000.0 8000.0 10000. 0 AutoDELFIA-1235 ours set 图 5 C肽测试结果线性回归曲线 Fig 5 Linearity Regress Currve of the C-peptide test 由图 4 可以看出，两台测试仪的测试结果非常一致。 图 5 曲线的线性回归方程为： y = 1.0201x 18.519 相关系数为： r2=0.9974，r=0.9987 显著性检验： P0.01 可见，两组数据的相关性很好。 3.3 稳定性稳定性 将先前检测过
15、的胰岛素（Insulin）项目的血清样本静置两小时后再用待检验机测试一次， 两组测试结果的荧光值作相关曲线如图 6 所示，经数理统计分析的线性回归方程如图 7 所示 020406080100120 0 50000 100000 150000 200000 250000 Y fluorescence intensity X testing times the first times the second times 图 6 相隔两小时测试结果相关性曲线 Fig6 Pertinence curve of the two testing 0 50000 100000 150000 200000 25
16、0000 0100000200000300000 The first testing The second testing 图 7 相隔两小时测试结果线性回归曲线 Fig7 Linearity Regress Currve of the Two Testing 由图 6 可以看出，两次测试的结果非常一致。 图 7 中所示的线性回归方程为：y = 1.0114x + 819.97 相关系数为：r2=0.9997，r=0.9998 显著性检验：P0.01 检测稳定性：CV2.5% 可见，两组数据的相关性非常好。由此说明，待检验机的稳定性相当好。可见，两组数据的相关性非常好。由此说明，待检验机的稳定性相当好。 4 结论结论 因为 Perkin Elmer 公司的同类型产品 AutoDELFIA1235 是目前临床应用的时间分辨荧 光免疫分析仪中性能及各项指标最为先进的仪器，它的全自动性能避免了很多人为的污染因 素和其他能影响结果的外部干扰。而
