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1、中国协和医科大学 博士学位论文 一种新的哺乳动物蛋白质合成校正机制HDTD的初步研究 姓名：阳洪波 申请学位级别：博士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：强伯勤;袁建刚 20040601 中国协和医科大学博士研究生论文 中文摘要 近年来随着手性氨基酸检测分离技术的提高，入们发现在哺乳动物中枢神经系统 和内分泌相关组织中存在区域性的高浓度D 构象氨基酸。D 构象丝氨酸作为N 甲基 - D 一天冬氨酸( N M D A ) 受体的内源性配体，更新和补充了传统的神经递质的概念， 为深入了解N M D A 受体过度兴奋和下调所致的的急慢性神经系统疾病的发病机制提 供了新的思路。D 构象天冬氨酸在翠
2、酮、生长素释放激素和黄体酮等多种激素的生物 学合成过程中发挥重要作用。同时，越来越多的研究发现脑组织中D 构象氨基酸的 增多与A l z h e i m e r 病( A D ) 有一定的关系。目前D 构象氨基酸的生物学功能及其相 关的代谢途径已经成为一个全新的研究领域。 我们从联合基因公司提供的人D 酪氨酰- t R N A 脱酰酶( H u m a nD - T y r - t R N A D e a c y l a s e ，H D T D ) 的e D N A 序列入手，对H D T D 基因序列进行了分析和补充。H D T D e D N A 全长1 3 3 8 b p ，含有一个编
3、码2 0 9 个氨基酸残基的开放阅读框架。序列第1 6 7 1 6 9 位核苷酸为起始密码子，旁侧序列符合K o z a t 规律，3 末端具有典型的加尾信号。 此e D N A 序列在G e n B a n k 中的接收号为A F 3 3 2 3 5 6 。通过B L A S T 比较发现，此e D N A 编码的蛋白与大肠杆菌、酵母、流感嗜血杆菌的D T y r - t R N A T M 脱酰酶具有显著同源 性，与大肠杆菌D T D 基因的一致性为3 9 。与酵母D T D 基因的一致性为4 7 。进 一步分析发现，它具有与大肠杆菌、酵母、流感嗜血杆菌的D T y r - t R N A
4、 T y 。脱酰酶相 同的T y r 结构域。_Deacylase(DTD) 此基因是第一个在哺乳动物中发现的D T y r - t R N A T y r 脱酰酶基因。正常成人多组 织膜N o r t h e m 杂交显示H D T D 有一个约1 3 k b 的转录本，其m R N A 在正常人体组织 中广泛表达，在脑组织和睾丸组织中高表达，这与D 构象氨基酸在人体组织中的区 域性高浓度分布相一致。我们在大肠杆菌中原核表达并初步纯化了人D T D 蛋白和人 酪氨酰t R N A 合成酶，在体外转录了人t R N A T y ，制备了底物L - T y r - t R N A T y r 和
5、 D T y r - t R N A l y ，初步验证了D T D 蛋白的脱酰酶活性以及立体构象选择性：它能够水 解D - T y r - t R N A T M 从而阻止D 构象氨基酸参与构成蛋白质。 主里塑塑堕型查兰堕主旦塞皇丝苎 N M D A 受体是哺乳动物中枢神经系统中的一种谷氨酸受体，它在突触可塑性、 学习和记忆等生理过程以及癫痫、神经退行性病变等病理性过程中发挥重要作用。 N M D A 受体上有谷氨酸结合位点和D S e r i n e 结合位点，只有当二者同时激动，才会 引起N a + 、C a 2 + 离子内流和K + 外流。J u l i eS o u t o u r
6、i n a 等人报道，D T D 蛋白能够水解包 括D S e r - t R N A 在内的多种D 氨酰t R N A ，从而参与维持细胞中游离D 构象氨基酸的 浓度。因此，我们研究了H D T D 蛋白和L 谷氨酸对S H S Y 5 Y 细胞的非选择性阳离子 通道对N a + 、K + 和c a 2 + 通透性的影响，结果发现，只有在H D T D 蛋白存在的情况下， L 谷氨酸才能激动谷氨酸敏感的非选择性阳离子通道，导致这些离子通道通透性增 加。这提示H D T D 蛋白参与维持游离D 构象丝氨酸浓度，从而对N M D A 受体功能的 维持有定的影响。 为了进一步研究的需要，我们用原核
7、表达的H D T D 蛋白免疫家兔，制备了多克 隆抗体，E L I S A 实验证明抗体滴度达到l ：1 0 万以上。用抗H D T D 抗体对大鼠大脑 皮层和海马组织行免疫组织化学分析，发现D T D 蛋白在大脑皮层和海马组织中广泛 表达，主要定位于神经元细胞核中，而胶质细胞中几乎没有检测到相应的信号。 基于H D T Dm R N A 在人脑和睾丸中的高表达，以及这些区域中D 构象氨基酸浓 度明显高于其他组织，推测D 构象氨基酸的存在可能对H D T D 基因表达有一定的调 控作用。同时生物信息学分析发现在H D T D 基因上游存在氨基酸反应元件( A A R E ) ， 因此我们在培养
8、基中添加不同终浓度的D 构象氨基酸后，提取S H S Y 5 Y 细胞总R N A 转膜，N o r t h e r n 杂交显示H D T D 转录水平随D 构象氨基酸浓度增高而增多，提示氨 基酸底物对H D T D 基因表达有上调作用。 用一氧化氮诱导神经母细胞瘤来源的S H S Y 5 Y 细胞氧化损伤的实验结果表明， 随着氧化损伤时间的延长，H D T D 的转录水平逐渐降低。在哺乳动物中枢神经系统 中，一氧化氮在神经传导、记忆等过程中起重要作用，但是过量的一氧化氮具有神经 毒性，可导致多种类型的神经元凋亡。尤其是A D 的发生过程中，活化的胶质细胞释 放大量的一氧化氮，引起相邻的神经
9、元的氧化损伤。H D T D 基因在一氧化氮诱导的神 经细胞氧化损伤过程中表达下调，这种蛋白质合成校正机制的紊乱可能为A D 等神经 系统退行性病变的发生机制提供新的线索。因此，我们对A D 病人脑组织切片进行了 免疫组织化学分析，发现H D T D 蛋自在皮层神经元细胞浆中出现类似于L e w y 小体 2 中国协和医科太学博士研究生论文 的染色，而在海马和皮层神经元胞浆中没有特异染色。 本论文在对联合基因公司提供的H D T D 基因序列进行信息学分析和补充的基础 上，从m R N A 和蛋白水平对H D T D 基因的表达谱进行了分析，并且发现该基因表达 受到其氨基酸底物的调节，这种异常
10、构象的氨基酸对哺乳动物基因表达调控的影响尚 属首次报道。首次在体外检测了哺乳动物D 一酪氨酰t R N A 脱酰酶的活性，发现了 H D T D 蛋白对于S H S Y 5 Y 细胞膜上谷氨酸敏感的非选择性阳离子通道的作用。在分 析H D T D 基因在S H - S Y 5 Y 细胞氧化损伤过程中表达下调的基础上对A D 病人脑组织 切片进行了免疫组化分析，为进一步研究H D T D 与神经退行性疾病之间的关系奠定 了基础。 中国协和医科大学博士研究生论文 A B S T R A C T I th a sb e e nt h o u g h tt h a tD - a m i n oa c
11、i d sw e r ee x c l u d e df r o ml i v i n gs y s t e m se x c e p tf o rD a m i n o a c i d si nt h ec e l lw a l lo fm i c r o o r g a n i s m s H o w e v e r , D - a m i n oa c i d s ，i nt h ef o r mo ff r e ea m i n oa c i d s ， p e p t i d e sa n dp r o t e i n s ，w e r er e c e n t l yd e t e
12、 c t e di nv a r i o u sl i v i n go r g a n i s m sf r o mb a c t e r i at om a m m a l s R e g i o n a lh i g hc o n c e n t r a t i o no fD - s e r i n ee x i s t s i nm a m m a lb r a i n D - s e f i n ei sa l li n t e r n a ll i g a n df o r N m e t h y l - D - A s p a r t a t e ( N M D A ) r e
13、 c e p t o r , w h i c hu p d a t e dt r a d i t i o n a lc o n c e p to f “n e u r o t r a n s m i a e r s ” T h i si san e w t a r g e tf o rs o m ea c u t ea n dc h r o n i cn e u r o l o g i c a ld i s e a s e sd u et ou p o rd o w n - r e g u l a t i o no f N M D A r e c e p t o r s I n c r e a
14、 s e dc o n c e n t r a t i o n so f D - a m i n oa c i d sa s er e l a t i v et oA l z h e i m e r Sd i s e a s e ( A D ) T h e r ea r ea m o u n t so f D a s p a r t a t ei n B a m y l o i d a lp e p t i d es e p a r a t e df r o mn e u r o f i b f i l l a r yt a n g l e sa n d n e u r i t i cp l
15、a q u e R a c e m a t i o no f A s p ”i n9 1 3a c c e l e r a t e di t sp r e c i p i t a t i o n A l lt h e s ed a t as u g g e s tt h a tt h e a n - c o r r e o t i n c o r p o r a t i o n o fD - a m i n oa c i d si sa l l i m p o r t a n t f a c t o ri nt h e p a t h o g e n e s i s o f n e u r o
16、 d e g e n e r a t i v ed i s e a s e s F u l l - l e n g t he D N A o f H D T Dw a sc l o n e df r o mh u m a n3 - m o n t hf e t a lb r a i nl i b r a r y I t sf u l ll e n g t hi s 1 2 1 9 b p ，c o n t a i n i n g a no p e n r e a d i n gf r a m ee n c o d i n g2 0 9a m i n oa c i d s T h eA T G a tt h ep o s i t i o no f 4 8 - 5 0 w a sp r e d i c t e da st h es t a r tc o d o nb e c a u s et h e s e q u e n c ea r o u n dt h ep o t e n t i a lt r a
