《一、egcg对原代培养大鼠皮层神经元氧糖剥夺后氨基酸递质释放的影响二、hek293转染细胞ltypecav12钙通道电生理研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一、egcg对原代培养大鼠皮层神经元氧糖剥夺后氨基酸递质释放的影响二、hek293转染细胞ltypecav12钙通道电生理研究（47页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、华中科技大学 硕士学位论文 一、EGCG对原代培养大鼠皮层神经元氧糖剥夺后氨基酸递质释 放的影响二、HEK-293转染细胞L-typeCav1.2钙通道电生理研究 姓名：丁杰 申请学位级别：硕士 专业：药理学 指导教师：郭莲军 2010-05 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2 中文摘要中文摘要 第一部分第一部分 EGCG 对原代培养大鼠皮层神经元氧糖剥夺对原代培养大鼠皮层神经元氧糖剥夺 后氨基酸递质释放的影响后氨基酸递质释放的影响 目的：目的：观察表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对原代培养的大鼠乳鼠皮质神 经元缺氧缺糖损伤的保
2、护作用及可能的作用机制。 方法：方法：1. 应用原代培养大鼠乳鼠皮 质神经元，诱导氧糖剥夺损伤模型，在氧糖剥夺 4 小时之前，预先给予 EGCG (25mol/L、50mol/L 和 100mol/L)，通过 MTT 和乳酸脱氢酶的测定观察 EGCG 对 原代培养的皮层神经元缺氧缺糖损伤的保护作用。2. 使用高效液相色谱法，测定皮 层细胞外液中兴奋性氨基酸天冬氨酸、谷氨酸及抑制性氨基酸牛磺酸、甘氨酸及- 氨基丁酸的含量。结果：结果：1. 低浓度的 EGCG (25mol/L 和 50mol/L) 对皮层细胞氧 糖剥夺损伤具有保护作用，但是高浓度的 EGCG (100mol/L) 则没有显示对细
3、胞的保 护作用。 2. EGCG 能显著抑制培养的皮层细胞氧糖剥夺(oxygenglucose deprivation， OGD)损伤后兴奋性氨基酸谷氨酸的释放，EGCG 预处理组与单纯损伤组细胞培养液 中谷氨酸水平的比较显示差异有统计学意义（P 99.5%） ； 邻苯二甲醛（OPA，sigma 公司，美国） ； 2-巯基乙醇（2-MCE，成都市科龙化工试剂厂，分析纯，99%） ； 磷酸二氢钾（天津市化学试剂三厂，分析纯，99.5%） ； 氢氧化钠（天津市化学试剂三厂，分析纯，96.0%） ； 乙 腈（色谱纯） 美国天地(Tedia)公司 乙 腈（分析纯） 天津市科密欧化学试剂有限公司 天冬氨
4、酸、谷氨酸、牛磺酸、甘氨酸及-氨基丁酸（购自 Sigma 公司） 。 1.2 主要实验仪器主要实验仪器 日立 L2000 高效液相色谱仪及荧光检测器（日本） ； 台式离心机(型号:HDG-04,长沙平凡仪器仪表有限公司)； 超声波清洗器(型号:KQ-100B,昆山市超声仪器有限公司)； pH 计(型号:PHS-3B,上海精科)； VACUUM PRESSURE PUMP(型号:DP-01)； 分析天平(型号:ER-182A,分度值 0.1mg，日本)。 1.3 相关溶液的配置相关溶液的配置 （1）硼酸盐缓冲液：ph=9.0 0.4mol/L 硼酸：硼酸 1.2433g 加水于 50ml 容量瓶
5、中定容。 0.1mol/L 硼砂：硼砂 1.9091g 加水于 50 容量瓶中定容。 缓冲液（ph=9.0） ：0.1mol/L 硼砂 8ml，0.4mol/L 硼酸 2ml 混匀。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 22 （2）衍生化试剂： 将 25mg OPA、 40l 二-巯基乙醇溶于 0.5ml 甲醇中， 加入硼酸盐缓冲液 （pH=9.0） 5ml，密封后 04避光保存。每日补 1015l 二-巯基乙醇。取 20l 处理好的样品置 于自动进样管中，自动进样器吸取 100l 衍生化试剂加入其内，混匀静置 90s 后进样 10l。
6、 （3）流动相：磷酸盐缓冲液（pH=6.8，0.04mol/L） 取磷酸二氢钾 3.4000g，加水 250ml 使之溶解，用 0.1mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH 值至 6.80，用水稀释至 500ml 摇匀，过滤。 （4）氨基酸标准储备液配制： 各氨基酸纯品用 50%甲醇水配制成 1mM 储备液。临用前稀释成系列混标 1.4 样品预处理样品预处理 冰冻样品融化后取 100l，加入甲醇 200l，混匀，10,000r/min，离心 10min，取 上清过滤。 1.5 色谱条件色谱条件1 色谱柱：VERIAN ODS C18 色谱柱（45mm*150mm, 5m)；柱温：35；流动相： 磷
7、酸盐缓冲液-甲醇；流速 1.0ml/min。氨基酸标准品单标与混标图 （见下图） 1.6 实验数据统计学分析实验数据统计学分析 实验数据以x S.D.表示。采用 SPSS13.0 统计软件进行统计和分析，组间两两比较 采用 one-way analysis of variance(ANOVA)、LSD test (Least-significant difference) 及 SNK 法分析差异的显著性，p0.05 表示差异有显著性意义，p0.01 表示差异有极显 著性意义。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 23 华 中 科 技 大
8、 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 24 Fig.1. 氨基酸标准品的单标与混标图。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 25 有此我们可知这五种氨基酸的出峰时间分别为： 天冬氨酸 4.016 min 谷氨酸 4.751 min 甘氨酸 13.174min 牛磺酸 17.772min -氨基丁酸 22.824min 2. 结果结果 2.1 EGCG 对大鼠原代培养皮层细胞外液天冬氨酸含量的影响 结果显示：若对照组天冬氨酸含量为 100%，氧糖剥夺损伤组天冬氨酸与对照组 比较为 123.2%，差异无
9、统计学意义。而 EGCG（25M、50M 与 100M）预处理组 后天冬氨酸含量分别是 104.8%， 94.4%与 145.3%， 与 OGD 组相比较也无统计学差异。 说明 EGCG 对细胞外液中天冬氨酸的含量无明显影响（见图 Fig.2.） 。 Fig.2. In vitro effects of EGCG on Asp concentration in extracellular fluid of rat cortical neurons as measured by HPLC. The bar chart had depicted the effect of EGCG on cort
10、ical neurons suffered from oxygenglucose deprivation. There is no significant on cortical neurons. compared with control group. Drugs were preincubated at different concentrations for 24 h. Data (n=5; mean S.D.) were expressed as a control percentage. 图 2 用HPLC方法测量皮层细胞外液中天冬氨酸的含量的统计图， 氧糖剥夺损伤组天 冬氨酸与对照
11、组比较，差异无统计学意义。而EGCG（25M、50M与100M）预处 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 26 理后天冬氨酸含量与OGD组相比较差异无统计学意义（n=5; meanS.D.）。 2.2 EGCG 对大鼠原代培养皮层细胞外液谷氨酸含量的影响 结果显示：若对照组谷氨酸含量为 100%，氧糖剥夺损伤组谷氨酸与对照组比较 为 245.9%，差异具有统计学意义。EGCG（25M 与 50M）预处理组谷氨酸含量分 别是 116.4%和 97.5%，与 OGD 组相比较也具有统计学差异。而 EGCG（100M）预 处理组谷氨酸含量为
12、208.9%，与 OGD 组相比较差异具有统计学意义。说明 EGCG （25M 与 50M）对 OGD 损伤后细胞外液中谷氨酸的含量具有明显的抑制作用，而 EGCG（100M）高浓度组无明显抑制作用，与 OGD 组比较没有统计学差异（见图 Fig.3.） 。 Fig.3. In vitro effects of EGCG on Glu concentration in extracellular fluid of rat cortical neurons as measured by HPLC. The bar chart had depicted the effect of EGCG on
13、cortical neurons suffered from oxygenglucose deprivation. On cortical neurons, compared with control group, Glu level in extracellular fluid was markedly increased, whereas pretreated with EGCG 25M and 50 M for 24 h reversed this tendency. However, EGCG 100 M elevated Glu level and have no statistic
14、al significance compared with OGD group. Drugs were preincubated at different concentrations for 24 h. Data (n=5; mean S.D.) were expressed as a control percentage (* p 0.05 when compared with control group; # p 0.05 when compared with OGD group). 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 27 图
15、3 用HPLC方法测量皮层细胞外液中谷氨酸的含量的统计图， 氧糖剥夺损伤组谷氨 酸含量与对照组比较，谷氨酸含量明显上升，差异具有统计学意义。EGCG（25M与 50M） 预处理后谷氨酸含量下降， 与OGD组相比较具有统计学差异。 而EGCG （100M） 与处理组与OGD组对比差异无统计学意义（n=5; meanS.D.）。 2.3 EGCG对大鼠原代培养皮层细胞外液甘氨酸含量的影响 结果显示：若对照组甘氨酸含量为 100%，氧糖剥夺损伤组甘氨酸与对照组比较 为 41.2%，差异具有统计学意义。EGCG（25M 与 50M）预处理组甘氨酸含量分别 是 219.6%和 237.8%，与 OGD
16、组相比较差异具有统计学意义。而 EGCG（100M）预 处理组甘氨酸含量为与 141.1%，与 OGD 组相比较无统计学差异。说明 EGCG（25M 与 50M） 低浓度组对 OGD 损伤后细胞外液中甘氨酸的含量具有明显的提高作用， 而 EGCG（100M）高浓度组与 OGD 组相对于 EGCG（25M 与 50M）低浓度组这种 提高作用有所降低（见图 Fig.4.） 。 Fig.4. In vitro effects of EGCG on Gly concentration in extracellular fluid of rat cortical neurons as measured by HPLC. The bar chart had depicted the effect of EGCG on cortical neurons suffered from oxygenglucose deprivation (OGD). On cortical
