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1、南方医科大学2 0 0 7 级硕士学位论文 A T M 基因与肝癌细胞辐射损伤修复的关系研究 R e l a t i o n s h i pb e t w e e nA T Mg e n ea n dr a d i a t i o nd a m a g e r e p a i ro fh e p a t o m ac a r c i n o m ac e l l 课题来源：国家自然科学基金( 3 0 7 7 2 5 3 0 ) 广东省自然科学基金( 200 500 47 76 ) 专业名称 学位申请人 指导教师 答辩委员会主席 答辩委员会成员 肿瘤学 练建平 陈龙华教授 庄承海教授 刘孟忠教授
2、 陈应瑞教授 陈永清教授 闫卫平教授 论文评阅人张秀萍教授 商谊教授 袁亚维教授 20 10 年4 月10 日 广州 1一 摘要 研究背景 原发性肝细胞癌( H e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a ) 是我国常见的恶性肿瘤之一， 其年发病率约2 0 1 0 万，死亡率高居癌症死亡率的第二位。目前原发性肝癌的治 疗方式首选外科于术，但限于诊断水平、症状出现较晚等诸多因素，使得于术切 除率低( 2 0 ) 。现由于放射治疗设备和技术的发展，三维适形放射治疗已成为肝 癌非于术治疗的主要方法之一l l 】。然而，由于肝癌细胞的相对辐射抗拒性，使得 肝癌
3、的根治剂量明显高于肝脏的耐受剂量，尤其中晚期肝癌患者多数伴有肝病基 础，又限制了放疗剂量的提高，导致肝癌放疗效果彳i 佳【2 3 、4 1 。如何提高肝癌的 放射敏感性成为肝癌放射治疗的一个难点和方向。 放疗主要是电离辐射( i o n i z i n gr a d i a t i o n ，I R ) 通过直接作用或间接作用导致 细胞D N A 的损伤，从而引起细胞死亡【l 】。放疗效果不佳，主要有两方面的原因： l 、细胞本身原因或其肿瘤细胞微环境保护从而导致细胞对射线不敏感；2 、电 离辐射后损伤细胞的修复；后者是主要因素。细胞D N A 的损伤主要表现为单链 断裂( S S B ) 和
4、双链断裂( D S B ) ，如未及时修复会导致细胞死亡，丧失其再增 殖能力和突变等。现研究认为D N A 双链断裂( D S B ) 的修复是细胞辐射抗拒的 主要原因之一。较为公认的修复机制主要有两种：同源重组修复( H R R ) 和非 中文摘要 同源末端修复( N H E J ) 。在哺乳动物中，以N H E J 为主。最新研究表明是D S B 修复能力而非D S B 数目影响细胞的存活【5 。7 J 。 当I R 引起细胞D N A 断裂时，其第一步就是D N A 断裂检测点的出现：复杂 的磷酸化级联是启动C h e c k p o i n t 关键的一步，哺乳动物中，A T M 、A
5、 T R 、D N A P K c s 通过C H K l 、C H K 2 触发监测点反应是起着中心角色；在酵母中，R a d 5 3 、C h k l 、 D u n l 磷酸化，R a d 9 在受损的所有细胞周期中是一个检测反应的介质，也作为 A T M 的介导者，包括有M D C l ，还有乳腺及卵巢的抑癌基因B R C A l 。D S B 最 开始被D N A 末端有M R ( X ) N 复合物( M r e l 1R a d 5 0X r s 2 N B S l ) 检测到的，同 时这个复合物还引导修复及端粒的修复【8 】。 第二步就是机体对D N A 断裂的反应：损伤信号发
6、出后，有修复因子、周期 调控因子、转录因子的聚集。H 2 A X 的磷酸化( r - H 2 A X ) 也是最早出现的现象 之J 1 9 、1 0 I ，并与M D C l 、M R N ( X ) 、A T M 及其他一些有利于稳定的蛋白作用， 起到扩大损伤信号的作用。所以检测点产生D N A 断裂的反应，而且能调控修复， 增强修复的有效性，能在细胞周期阻滞或促进断裂自身修复中起着作用【1 1 1 。 修复蛋白被募集至D N A 断端时，就开始启动修复程序。两种主要修复方式 具体如下：1 、非同源末端连接( N H E J ) 因不考虑同源序列而成为首选的修复方 式，它以基本碱基配对的方式
7、直接把末端先连起来。因没有任何修饰，所以难 免会有D N A 少量插入或消失，对于非同源或不配对的序列来说，这不影响其修 复的完成。N H E J 机制主要有三个主要的物质：M R X 、K u 、D N A 连接酶。当D S B 生成时，M R X 及K u 快速的把末端连接起来并防止其降解，在其稳定过程中同时 刺激连接酶起作用。M R X 是N H E J 、H R 共有的唯一的蛋白复合物【l 引。M R X 由 M r e l l 、X r s 2 、R a d 5 0 蛋白组成，R a d 5 0 有高真性的序列及似乎能在分子间连接有 助于促进碱基配对及N H E J 反应的连接【1
8、3 ，J ，M r e ll 劈开发夹结构行使3 - - - - 5 核 外切酶的作用以助于连接断端；X r s 2 缠绕D N A 末端( 与- R a d 5 0 ) ，能在细胞周期 阻滞中其作用陋插】。M R X 本质作用是圈合D S B 及添补连接酶复合物，能起到核 酶的作用。在动物中，K u 是很必须的，属于D N A P K 复合物中的一部分，其催 硕士学位论文 化亚基D N A P K c s 是连接断端的因子，所以这可能是在动物中不用M R X 的原因。 在N H E J 中的作用是保护D S B 末端( N H E J 中) 及预防5 末端切除。连接酶有： L i 9 4 L
9、 i g a s eI V ，L i f l X R C C 4 、N e j l X L F 。在K u 的存在下，连接酶能连接不能配 对及不亲和的D N A 断裂端，这种灵活性在修复任何D S B 中有很大的潜在的优势。 2 、同源重组修复( H R ) 是对D S B 分子的改变，如序列相同有高度忠实性，否则 可能引起突变或有害的。所需基因主要有R A D 5 2 及其家族的R A D 5 0 ，R A D 5 1 ，R A D 5 2 ， R A D 5 4 ，R A D 5 5 ，R A D 5 7 ，R A D 5 9 ，R D H 5 4 ，M R E l1a n dX R S
10、2 ，所需酶有：D N An u c l e a s e s ( E x o l ，R a d l R a d l 0 ) ，h e li c a s e s ( S g s l ，S r s 2 ) ，t o p o i s o m e r a s e s T o p 3 ) ， p o l y m e r a s e s ( P o l 3 2 ) a n d1i g a s e sm a yr e q u i r e dt oc o m p l e t es p e c i f i cH R r e a c t i o n s H R 有3 个步骤：1 、其先决条件：5 端切除，M R
11、( X ) N 复合物中M R E l1 执行核外切酶目的是移除限制的D S B 有利于切除5 断端，M R X 的作用只执行更有 效的切除；因有R a d 5 0 连接，在5 降解中可能没有直接参与但提供有D S B 末端圈 合的监测点及融核的清除。2 、断端插入同源D N A 中并进行链改变或交换；3 、重 组中间物的溶解。H R 最核心的部分是杂合双链D l o o p 的形成及链的置换。这过 程主要有R a d 5 1 R a d 5 2 重组酶来完成，R a d 5 1 片段形成需要R P A ，P R A 是一个绕3 末端及清除第二产物的复合物，在切除后快速的缠绕D N A 末端及
12、直接跟R a d 5 2 ( 酵 母) 反应。而R a d 5 2 几乎用于所有的连接机制。【7 慨1 9 2 0 】 A T M ( a t a x i a t e l a n g i e c t a s i am u t a t i o n ) 基因是共济失调毛细血管扩张症( a t a x i a t e l a n g i e c t a s i a ，A T ) 的突变基因，A T M 基因定位于人类染色体1 l q 2 2 - - - 2 3 ，该基因全长约1 5 0 k b ，编码序列约1 2 k b ，共有6 6 个外显子，编码一个由 3 0 5 6 个氨基酸残摹组成的、约3
13、5 0 k d 的蛋白质，稍；A T M 蛋白，是一种磷酸化的大 分子核磷蛋白，属于磷脂酰肌醇3 激酶( P 1 3 K ) 家族成员。 A T M 基因在电离辐射( I R ) 损伤修复中发挥着重要作用，当I R 引起细胞内 D N A 双链断裂时，损伤信号引起A T M 蛋白激活和自磷酸化，A T M 二聚体分离【2 ， 可以和M D C l 、M R N ( X ) 等众多因子结合扩大损伤信号和招募修复因子。A T M 磷酸化 后其表达上调，磷酸化多种下游的靶分子，包括p 5 3 、C H K 2 、B R C A l 等；同时将 中文摘要 D N A 损伤信号传递给D N A - P
14、K ；k u 蛋白激活，结合在D N A 损伤区域，D N A P K c s 与 k u 蛋白形成一个复合体，直接参与D N A 损伤修复；p 5 3 是一个关键的D N A 损伤检 查点蛋白【2 2 1 ，通过特异性转录后调节机制，p 5 3 与下游G A D D 4 5 或p 2 1 相互作用， 上调G A D D 4 5 可以激活J N K 和或p 3 8 M A P K 信号途径参与细胞凋亡，调控p 2 1 可产 生细胞G 1 期阻滞；M D M 2 是p 5 3 基因负调控因子，M D M 2 与p 5 3 结合，通过泛素 ( u b i q u i t i n ) 依赖的蛋白酶体
15、( p r o t e o s o m e ) 途径降解p 5 3 ；A T M 对C H K 2 的激 活进一步磷酸化p 5 3 ，增加p 5 3 的稳定性，C d c 2 5 A C 使C H K 2 失活，阻止C D K l 激活，导致细胞G 2 期阻滞。其它参与D S B 修复有B L M 、B R C A l 、H 2 A X 、M r e l l 、 N B S l 、X R C C 4 、R a d s 掣2 3 1 。 A T M 基因是近年来研究肿瘤放射抗拒方面的一个热点基因，L I l 2 4 1 等证实抑 制A T M 基因后宫颈癌的放射敏感性有所提高，而在肝癌中此方面的
16、研究较少。本 课题组前期实验已证实A T M 基因在肝癌患者中是过度表达的 2 s 】。本研究试图应 用简单方便的s i R N A 干扰技术沉默肝癌细胞H e p G 2 中A T M 基因，并检测A T M 表达 沉默后H e p G 2 的放射生物学特征变化，以期了解辐射增敏机制，为下一步选择联 合治疗措施达到更好肝癌治疗疗效提供实验依据。 研究目的： 1 、设计并合成能高效抑制肝癌细胞H e p G 2 中A T M 基因的s i R N A 序列，分 别存m R N A 和蛋白水平检测其抑制效率。 2 、通过小分子R N A 干扰技术抑制肝癌细胞中A T M 基因的表达，检测A T M 基因表达沉默前后及在经x 线照射后细胞生物学特征变化。 研究方法： 1 、设计并合成能高效抑制肝癌细胞H e p G 2 中A T M 基因的s i R N A 序列。 用A m b i o n 公司在线s i R N A 设计软件确定特异针对人A T
