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1、 博 士 学 位 论 文 博 士 学 位 论 文 论文题目 ARI 筛选模型的建立及黄芪甲苷论文题目 ARI 筛选模型的建立及黄芪甲苷 对 VSMC 生长的影响和机制研究 对 VSMC 生长的影响和机制研究 A model for ARI screening and effect of astragaloside IV on growth of VSMC and its mechanism 作者姓名 肖 尚 志 作者姓名 肖 尚 志 指导教师 郑 筱 祥 教授 指导教师 郑 筱 祥 教授 学科(专业) 生 物 医 学 工 程 学科(专业) 生 物 医 学 工 程 所在学院 生物医学工程与仪器科
2、学学院 所在学院 生物医学工程与仪器科学学院 提交日期 二零零五年五月 提交日期 二零零五年五月 浙江大学博士学位论文 1 目 录 目 录 摘 要1 ABSTRACT.3 第一章 醛糖还原酶抑制剂筛选模型的建立6 第一节 概 述6 1.1 糖尿病慢性并发症.6 1.1.1 醛糖还原酶催化的多元醇旁路的激活7 1.1.2 蛋白激酶 C（PKC）激活9 1.1.3 蛋白质非酶糖基化10 1.1.4 脂质、蛋白质代谢紊乱11 1.2 糖尿病并发症治疗药物的研究与开发现状.11 1.3 本课题的研究目的及意义.13 第二节 醛糖还原酶抑制剂筛选模型建立16 2.1 平滑肌细胞培养和鉴定.16 2.1.
3、1 实验动物、实验器材、实验试剂.16 2.1.2 平滑肌细胞原代培养操作方法与步骤.16 2.1.3 培养结果及鉴定.18 2.2 醛糖还原酶活性及醛糖还原酶 mRNA 表达测定方法.19 2.2.1 实验器材、实验试剂.19 2.2.2 醛糖还原酶活性测定方法.19 2.2.3 醛糖还原酶 mRNA 水平测定-逆转录聚合酶链反应（RT-PCR） 20 2.3 促使 VSMC 细胞内 AR 高活性最适孵育时间的确定21 2.3.1 实验器材、实验试剂.21 2.3.2 细胞处理及实验分组.22 2.3.3 实验结果.22 2.4 促使 VSMC 细胞内 AR 高活性的最佳葡萄糖浓度的确定.2
4、3 2.4.1 实验器材、实验试剂.23 2.4.2 细胞处理及实验分组.24 浙江大学博士学位论文 2 2.4.3 实验结果.24 2.5 阳性药依帕司对模型 AR 活性的影响.25 2.5.1 实验器材、实验试剂.25 2.5.2 细胞处理及分组26 2.5.3 实验结果26 第三节 基于模型的相关药物筛选27 3.1 含药血清筛选.27 3.1.1 含药血清的制备.27 3.1.2 细胞分组与处理27 3.1.3 含药血清筛选结果.27 3.2 中药单体的筛选.28 3.2.1 细胞分组与处理28 3.2.2 筛选结果29 第四节 分析与讨论30 第二章 黄芪甲苷对平滑肌细胞增殖的抑制作
5、用31 及相关机制研究31 第一节 概 述31 1.1 血管平滑肌细胞的生物学功能.32 1.2 平滑肌细胞增殖与动脉粥样硬化的关系.33 1.3 平滑肌细胞凋亡与动脉粥样硬化的关系.36 1.3.1 VSMC 凋亡与 AS36 1.3.2 VSMC 凋亡的信号传递与基因调控.38 1.4 平滑肌增殖和凋亡及相关机制探讨方法.42 1.4.1 细胞增殖活力检测方法（WST）42 1.4.2 细胞凋亡检测的相关方法43 1.4.3 细胞内钙离子检测的相关方法45 第二节 黄芪甲苷对平滑肌细胞生长的抑制作用及相关机制研究50 2.1 前 言.50 2.2 黄芪甲苷对平滑肌细胞增殖活力的影响.50
6、2.2.1 实验材料50 浙江大学博士学位论文 3 2.2.2 细胞分组及增殖活力检测51 2.2.3 结果统计51 2.2.4 实验结果52 2.3 黄芪甲苷对平滑肌细胞凋亡的影响.52 2.3.1 实验材料52 2.3.2 细胞处理与分组及凋亡检测53 2.3.3 黄芪甲苷对平滑肌细胞凋亡的影响54 2.4 凋亡相关基因 Fas 和 Bcl-2 表达的检测56 2.4.1 实验材料56 2.4.2 实验操作与步骤56 2.4.3 实验结果57 2.5 黄芪甲苷对平滑肌细胞细胞内钙离子浓度的影响.59 2.5.1 实验材料59 2.5.2 细胞处理及细胞内钙离子检测60 2.5.3 黄芪甲苷
7、对平滑肌细胞细胞内 ca2+ 的影响61 2.6 黄芪甲苷对平滑肌细胞一氧化氮的影响.62 2.6.1 实验材料.62 2.6.2 细胞处理及细胞内 NO 检测.63 2.6.3 实验结果.64 第三节 分析与讨论66 3.1 黄芪甲苷抑制平滑肌细胞增殖及机制66 3.1.1 AR 与平滑肌细胞增殖.66 3.1.2 NO 与平滑肌细胞增殖.67 3.2 黄芪甲苷诱导平滑肌细胞凋亡及机制68 3.2.1 NO 与平滑肌细胞凋亡.68 3.2.2 钙离子与平滑肌细胞凋亡70 3.2.3 Fas 与平滑肌细胞凋亡.70 3.2.4 Bcl-2 与平滑肌细胞凋亡.71 总结与展望73 1、研究工作总
8、结.73 浙江大学博士学位论文 4 2、进一步的工作展望.73 博士期间相关论文发表情况75 参考文献76 致 谢89 摘 要 摘 要 糖尿病是一种伴有诸多严重并发症的疾病，在退行性糖尿病并发症病变的发 生和发展过程中，多元醇代谢通路(polyol pathway)起了十分重要的作用。醛糖还 原酶（aldose reductase，AR)是多元醇代谢通路中的关键限速酶，是治疗糖尿病并 发症的靶位酶,该酶以 NADPH 为辅酶，使葡萄糖还原为不易透过细胞膜的山梨醇， 引起细胞的渗透性损伤，是糖尿病并发症发生的重要原因。目前许多前沿研究已 经证实，糖尿病慢性并发症如白内障，糖尿病视网膜病，糖尿病神
9、经病，糖尿病 肾病等，都与体内山梨醇的蓄积密切相关。大量动物实验和临床研究表明，醛糖 还原酶抑制剂（aldose reductase inhibitor，ARI）可以有效地改善糖尿病患者聚醇 代谢异常，从而预防与延缓糖尿病并发症的发生与发展。 由于目前可用于治疗糖 尿病并发症的药物不足以满足临床需要，现有的醛糖还原酶抑制剂索比尼尔和托 瑞司他等有不同程度的副作用。因而发现和寻找新的安全有效的醛糖还原酶抑制 剂显得非常有必要。本研究的目的就是建立一种简便、可靠并可以用于高通量筛 选的醛糖还原酶抑制剂筛选模型，并在模型的基础上进行了相关的药物筛选以及 药物作用机制的研究。 1、建立了可用于从中药及
10、其他化合物中筛选醛糖还原酶抑制剂的细胞模型。 通过组织贴块法培养大鼠主动脉平滑肌细胞，高效液相色谱测定反应体系中反应 后剩余的醛糖还原酶的辅酶 NADPH 的荧光强度，推算出反应体系中醛糖还原酶 的活性，逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测醛糖还原酶 mRNA 的表达。用 这些方法检测了培养在含有不同浓度葡萄糖的DMEM中平滑肌细胞不同时间点的醛 糖还原酶活性及醛糖还原酶 mRNA 表达情况，结果发现，当平滑肌细胞在葡萄糖浓 度为 37.5mmol/L，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）浓度为 10%的 DMEM 中 孵育 48 小时后醛糖还原酶活性最强 （P0.01
11、） ， 醛糖还原酶 mRNA 的表达量最高， 从而确定了促使平滑肌细胞内 AR 活性增强的最佳葡萄糖浓度和最佳孵育时间。 已 知的醛糖还原酶抑制剂 Epalrestat 对在葡萄糖浓度为 37.5mmol/L，FBS 浓度为 10%的 DMEM 中孵育 48 小时的平滑肌细胞醛糖还原酶抑制剂活性有显著的抑制 作用（P0.01），验证了模型的可行性。根据这些实验结果建立了基于平滑肌细 胞的醛糖还原酶抑制剂筛选的细胞模型。 浙江大学博士学位论文 2 2、在此模型的基础上进行了相关的药物筛选工作，我们对黄芪、知母等药物 的提取物含药血清，单体药物等进行了筛选，发现黄芪甲苷和知母皂甙可显著抑 制细胞模
12、型醛糖还原酶抑制剂的活性，在此基础上进一步研究了黄芪甲苷对平滑 肌细胞增殖和凋亡的影响及相关机制。 3、研究结果表明，黄芪甲苷可降低平滑肌细胞的增殖活力和诱导平滑肌细胞 凋亡。 通过 WST-1 检测细胞代谢活性与增殖活力，AnnexinV-FITC 和 PI 双染细胞 后，流式细胞仪检测平滑肌细胞凋亡情况。实验结果显示，2g/ml 和 20g /ml 黄 芪甲苷可显著降低细胞增殖活力(P0.01)，20g/ml 黄芪甲苷和阳性药 interleukin-1（10ng/ml）使平滑肌细胞凋亡率显著增高（P0.01）这表明黄芪甲 苷可通过降低细胞增殖活力和促使平滑肌细胞凋亡来抑制平滑肌细胞的增殖
13、。 4、采用激光共聚焦显微镜分别检测经 Flue-3AM 和 DAF-2AM 染色后细胞 内钙离子浓度变化和一氧化氮（Nitric oxide，NO）浓度变化，Fas 和 Bcl-2 抗体检 测凋亡相关基因 Fas 和 Bcl-2 表达等方法进行的机制研究结果显示， 黄芪甲苷可使 平滑肌细胞内钙离子浓度迅速升高，诱导平滑肌细胞释放 NO 增加，能促使 Fas 蛋白表达增强及降低 Bcl-2 蛋白表达。 这表明黄芪甲苷降低平滑肌细胞增殖活力与 它能抑制细胞内醛糖还原酶活性以及能诱导平滑肌细胞释放 NO 有关， 其促使 Fas 蛋白表达增强， 降低 Bcl-2 蛋白表达以及诱导平滑肌细胞释放 NO
14、 是诱导平滑肌细 胞凋亡的重要机制之一。 本论文研究建立了醛糖还原酶抑制剂筛选细胞模型，为抗糖尿病并发症药物 的筛选提供了一种筛选方法，在此模型的基础上筛选出了黄芪甲苷和知母皂甙等 可有效抑制醛糖还原酶活性的药物，并着重研究了黄芪甲苷对与糖尿病血管并发 症有密切关系的平滑肌细胞增殖和凋亡的影响及相关机制，研究表明，黄芪甲苷 可显著降低平滑肌细胞醛糖还原酶活性，抑制平滑肌细胞的增殖并诱导其凋亡， 可起到预防和延缓糖尿病并发症特别是血管并发症的作用， 具有一定的开发前景。 关键词：关键词：醛糖还原酶抑制剂，平滑肌细胞，模型，药物筛选，黄芪甲苷, 增殖， 凋亡，钙离子，一氧化氮 浙江大学博士学位论文
15、 3 ABSTRACT Diabetes mellitus (DM) is a serious disease with severe complications. Polyol pathway plays an important role during the development of degenerative diabetic complications. Aldose reductase (AR) is key rate-limiting enzyme in polyol pathway, it is the target enzyme for treatment of DM complications. Aldose reductase reduces excess d-glucose into d-sorbitol with the associated conversion of NADPH to NADP+1. Available experimental data link D-glucose metabolism to long-term diabetic complications such as cataract, neuropathy, nephropathy, and retinopathy. Aldose reductase inhibitor
