《amirna介导抗性转基因烟草植株的抗病性分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《amirna介导抗性转基因烟草植株的抗病性分析（106页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名： 弹 导师签名：羽磁孕 I ， 日 期：2 叟 绑么目f 日 目录 1 3 4s i R N A 策略在植物抗病毒中的应用8 1 4m i R N A 的产生及其作用机制9 1 4 1m i R N A 的功能1 1 1 4 2a m i R N A 策略及其应用1 1 1 4 3a m i R N A 策略在植物抗病毒方面的研究进展1 2 1 5 本课题的研
2、究目的及意义1 2 2 材料与方法1 4 2 1 实验材料1 4 2 1 1 植物材料1 4 2 1 2 植物材料培养1 4 2 1 3 菌株、质粒与毒源。1 4 2 1 4 酶与各种生化试剂1 4 2 1 5P C R 引物15 舢2洲7 舢删-M 6M 9 0 舢7 胛1胛Y 2 2 实验方法18 2 2 1 拟南芥总D N A 的提取1 8 2 2 2p r e m i R N A 的扩增1 8 2 2 3a m i R N A 的筛选2 0 2 2 4p r e m i R N A 的改造2 1 2 2 5 植物表达载体的构建2 5 2 2 6 农杆菌介导转化烟草2 8 2 2 7 转
3、基因植株的P C R 鉴定。2 9 2 2 8 转基因植株中靶基因剪切位点的验证3 4 2 2 9P C R 目的片段的回收3 4 2 2 1 0 目的片段与克隆载体连接。3 4 2 2 11 大肠杆菌感受态细胞制备3 5 2 2 1 2 大肠杆菌感受态细胞的转化3 5 2 2 1 3 大肠杆菌感受态细胞的转化3 5 2 2 1 4 重组质粒的酶切鉴定3 8 2 2 1 5 农杆菌感受态的制备3 9 2 2 1 6 植物总R N A 的提取3 9 2 2 1 7 植物小R N A 的提取4 1 2 2 1 8 探针的制备4 2 2 2 1 9 杂交4 3 2 2 2 0 荧光定量P C R 4
4、 4 2 2 2 15 R L M - R A C E 4 4 3 结果与分析4 7 3 1 拟南芥p r e m i R N A 的扩增4 7 3 1 1 拟南芥p r e m i R l 5 9 a 的扩增4 7 3 1 2 拟南芥p r e m i R l 6 7 b 的扩增4 8 I I 3 7 2T l 代转基因植株对F X 2 1 P V X 的抗病性分析6 8 3 7 3 转基因植株广谱抗性的鉴定7 4 3 8 双抗转基因植株的获得7 7 3 8 1 双抗表达载体的构建以及再生植株的获得7 7 3 8 2 双抗转基因植株的抗病性分析7 9 4 讨论8 2 5 结论8 5 参考文献
5、8 6 附录9 3 致谢。9 6 攻读学位期间发表的学术论文9 7 I I I L 花椰菜花叶病毒3 5 S 三甲基溴化铵 D E P C ：D i e t h yp y r o c a r b o n a t e ，焦碳酸二乙酯 D G ：B m d m ge n e r g y ，结合能 d N T P ：D e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e ，脱氧核糖核苷三磷酸 d p i ：D a yp o s ti n o c u l a t i o n ，接种后天数 d s R N A ：D o u b l e s
6、 t r a n d e dR N A ，双链R N A 分子 E B ：E t h i d i u mb r o m i d e ，溴化乙锭 E D T A ：E t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d ，乙二胺四乙酸 E L I S A ：E n z y m e 1 i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ，酶联免疫反应 G R S V ：G r o u n d n u tr i n gs p o tv i r e s ，花生环斑病毒 K a n ：K a n a m y
7、c i n ，卡那霉素 m i R N A ：m i c r o R N A ，小R N A M S ：M u r a s h i g ea n dS k o o gm e d i u m ，M S 培养基 N a A C ：N a t r i u ma c e t a t e ，醋酸钠 P B S ：P h o s p h a t eb u f f e r ，磷酸缓冲液 P C R ：P o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，聚合酶链式反应 P T G S ：P o s t - t r a n s c r i p t i o n a lg e
8、n es i l e n c i n g ，转录后基因沉默 P V X ：P o t a t ov i r u sX ，马铃薯X 病毒 P V Y ：P o t a t ov i r u sY ，马铃薯Y 病毒 R D R ：R N A - d e p e n d e n tR N Ap o l y m e r a s e ，R N A 依赖的R N A 聚合酶 R I S C ：R N A - i n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e x ，R N A 诱导沉默复合体 R N A i ：R N Ai n t e r f e r i n g ，R N
9、A 干扰 R N a s e A ：R i b o n u c l e a s eA ，核糖核酸酶A R N a s eI I I ：R i b o n u c l e a s e ，核糖核酸酶 R T - P C R ：R e v e r s et r a n s c r i p t i o nP C R ，反转录P C R R A C E ：R a p i da m p l i f i c a t i o no fc D N Ae n d s ，e D N A 末端快速扩增 r p m ：R e v o l u t i o n sp e rm i n u t e ，转分 S D S ：S
10、o d i u md o d e c y ls u l f a t e ，十二烷基硫酸钠 s i R N A ：S m a l li n t e r f e r i n gR N A ，小干涉R N A T C S V ：T o m a t oc h l o r o t i cs p o tv i r u s ，马铃薯枯斑病毒 T G S ：T r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g ，转录水平的基因沉默 T M V ：T o b a c c om o s a i cv i r u s ，烟草花叶病毒 T r i s ：T r i
11、 s ( H y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e ，三羟甲基氨基甲烷 T S W V ：T o m a t os p o t t e dw i l tv i r u s ，马铃薯斑枯病毒 T u M V ：T u r n i pm o s a i cv i r u s ，芜菁花叶病毒 T Y M V ：T u r n i py e l l o wm o s a i cv i r u s ，芜菁黄花叶病毒 V I G S ：V i r u si n d u c e dg e n es i l e n c i n g ，病毒诱导的基因
12、沉默 W S M o V ：W a t e r m e l o ns i l v e rm o t t l ev i r u s ，西瓜银斑病毒 a - N A A ：a - N a p h t h a l e n ea c e t i ca c i d ，a 萘乙酸 2 山东农业大学硕士学位论文 摘要 近年来，人工合成的m i c r o R N A ( a m i R N A ) 的应用为植物抗病育种提 供了新的途径。m i c r o R N A ( m i R N A ) 是一类由核基因编码的，转录后在 细胞质中经一系列剪切而形成的小R N A ，它能指导靶基因的剪切或翻译 抑制来调控基因的表达。a m i R N A 技术是在内源基因沉默机制上发展起来 的，利用该策略，设计特异的a m i R N A 就可以使靶基因发生高效的基因沉 默。理论上讲，运用该策略也能用于培育抗病毒的转基因植株。本研究中， 利用拟南芥的三个内源的m i R N A 前体( p r e m i R l 5 9 a ，p r e m i R l 6 7 b 和 p r e m i R l 7 1 a ) 为骨架，设计特异的a m i R
