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1、浙江大学 2005 届硕士医学专业学位论文 1 2型糖尿病病人型糖尿病病人MTHFR基因多态性与胰岛素抵 抗及高敏 基因多态性与胰岛素抵 抗及高敏 C 反应蛋白水平的研究反应蛋白水平的研究 浙江大学医学院 内科学（内分泌与代谢病） 2002 级硕士研究生 梁文昌 指导教师 任跃忠 副教授 摘 要 目的目的：探讨 2 型糖尿病（2 型 DM）患者亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因多态性 与胰岛素抵抗的关系，以及血浆总同型半胱氨酸（tHcy） ，高敏 C 反应蛋白 （hs-CRP）间的相关性研究。 方法方法：用聚合酶链反应-限制性内切酶片断长度多态性技术（PCR-RFCP）检查 82 例 2
2、型 DM 患者及 40 例年龄、性别相配的健康人的 MTHFR 基因多态性，胰岛素敏感 性用稳态模型的胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）评估，用荧光极化免疫分析法测定 血浆 tHcy 水平， 叶酸、维生素 B12用微粒子化学发光免疫法测定，hs-CRP 的测 定用乳胶免疫增强比浊法测定。 结果：结果：2 型 DM 组 MTHFR 基因型 CC 型占 40.2%，CT 型占 41.5%,TT 型占 18.3%。健 康对照组中，CC 型占 42.5%,CT 型占 45%，TT 型占 12.5%，T 等位基因频率 DM 组为 39%， 健康组为 38%， 基因型的分布频率 DM 组与健康组间无统计学差
3、异 （2 =0.688,P=0.709） 。以 HOMA-IR 的 50 分位数为切割点将 DM 组分为高 HOMA-IR 组与低 HOMA-IR 组，经 logistic 回归分析示 MTHFR 基因 T 等位基因频率为高 HOMA-IR 的危险因素（OR 值=5.906,P=0.03） 。在 2 型 DM 组中，TT 组的 tHcy 水平为 13.367.16mol/L，显著高于 CT 组 8.543.48mol/L 或 CC 组 8.03 3.48mol/L（P 值分别为 0.002 和 0.001）,TT 组的 hs-CRP 水平 2.491.26mg/L， 显著高于 CC 组 1.1
4、8 0.63mg/L（P 值 0.006）,经线性回归分析及多元线性回归分 析显示 tHcy 水平与 hs-CRP 呈正相关（偏回归系数=0.342，P 值=0.01） 。 结论结论： （1）MTHFR 基因 C677T 突变在 2 型 DM 患者与正常人之间无差异;（2）MTHFR 基因的 T 等位基因突变为胰岛素抵抗的危险因素之一。 （3）MTHFR 基因纯合子 突变的 2 型 DM 患者 tHcy、 hs-CRP 均高于正常型 DM 患者， tHcy 水平与 hs-CRP 呈正相关。 关 键 词关 键 词 ： MTHFR 基 因 高 同 型 半 胱 氨 酸 血 症 高 敏 胰 岛 素 抵
5、 抗 高敏 C 反应蛋白 浙江大学 2005 届硕士医学专业学位论文 2 Abstract Objective: To investigate the homocysteine (Hcy) levels and the C677T polymorphism of 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR), a crucial factor of the Hcy metabolism, and clarify the relationship between Hcy levels and high sensitivity C reactiv
6、e protein (hs-CRP). Methods: By using the case-control study, 82 patients with type 2 diabetes mellitus were consecutively enrolled. 40 healthy controls were matched for age and sex. The MTHFR genotype was analyzed by PCR followed by HinfI digestion. Homeostasis model assessment index (HOMA-IR) was
7、calculated to estimate insulin resistance; Plasma total homocysteine levels were measured using the fluorescence polarization immunoassay technology. Plasma high-sensitivity CRP was measured using a particle-enhanced immunoturbidimetric assay. Results: Genotypic analysis revealed that the frequency
8、of the mutation T allele in type 2 diabetic patients was 39.0%. The genotype distribution did not differ between the control subjects and the type 2 diabetic patients (2 = 0.668, P=0.709). Patients with HOMA-IR exceeded the 50 percentile was defined as the high insulin resistance group. Logistic reg
9、ression showed that the T allele was a risk factor to the insulin resistance (OR=5.906 P=0.03). Plasma tHcy concentrations and hs-CRP levels were significantly higher in patients with TT homozygous than in those with CC homozygous. Multivariate linear regression analyses revealed a strong independen
10、t association between tHcy and hs-CRP. Conclusion: There are no difference in the distribution of the C677T mutation of MTHFR gene between the Chinese type 2 diabetes patients and the healthy controls. The MTHFR gene T allele is one of the genetic predispositions to develop insulin resistance. In th
11、e patients with TT homozygous, Plasma tHcy levels and hs-CRP concentrations are greater than the CC homozygous patients. Plasma hs-CRP is an independent determinant of plasma tHcy. Keywords: MTHFR Gene Hyperhomocysteinemia Insulin Resistance High Sensitivity C Reactive Protein MTHFR 基因突变被认为是心血管病变的危险
12、因素1,2，在糖尿病 视网膜病变、 糖尿病肾病中， MTHFR 基因突变率明显高于对照组3,4。 一些文献报道糖尿病患者中 MTHFR 的突变率可高达 40%4， MTHFR 基因常见的突变点为 C677T，即于 677 位核苷酸中，丙氨酸被缬氨酸 取代导致酶产生不耐热的变异5,6，使同型半胱氨酸水平升高，导致 高同型半胱氨酸血症7,8。最近研究提示，同型半胱氨酸的水平增高 浙江大学 2005 届硕士医学专业学位论文 3 与胰岛素抵抗呈正相关9，高同型半胱氨酸血症对血管的内皮细胞具 毒性作用10，且被认为是 CVD 的独立危险因子11-13。 众多原因中导致高 Hcy 血症主要为 MTHFR
13、基因的突变所长致 14，但至今尚无 MTHFR 基因多态性与 IR 的相关性研究。高 Hcy 血症与同样作为CVD独立危险因素的CRP15的相互关系所知甚少。 由此， 本研究的目的旨在探讨 2 型 DM 患者 MTHFR 基因多态性对 IR 及 CRP 的影响。 对象与方法对象与方法： 一、对象： 研究对象为浙大医学院附属第二医院住院及门诊病人。 纳入标准 为：2 型 DM 患者，符合 ADA 诊断标准，年龄35 岁，病情5 年，无 叶酸，维生素 B 族缺乏的非吸烟患者。排除标准：有严重的心血管或 肝脏疾病，肾功能不全（血清肌酐1.4mg/dl） 、严重的脂代谢紊乱、 正在服用噻唑烷二酮类药物
14、、非甾体抗炎药、维生素 B12 和（或）叶 酸制剂、合并感染，甲状腺疾病或肿瘤的 2 型 DM 患者。 二、方法二、方法： 1.MTHFR 基因检测：取清晨空腹外周静脉血 2 毫升,置于 EDTA 抗凝 管中,按常规方法分离外周血淋巴细胞基因组 DNA。MTHFR 基因分 型 ： 扩 增 含C677T的DNA片 段 的PCR引 物 为5 TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA3 和5 CACTTTGTGACCATTCCGGTTTG 3； 扩增含 A1298C 的 DNA 片 浙江大学 2005 届硕士医学专业学位论文 4 段的 PCR 引物为 5 CTTTGGGGAGCTGAAGGAC
15、TACTAC 3 和 5 CTTTGGGGAGCTGAAGGACTACTAC 3。25l PCR 反应体系中含 0.1g 模板 DNA、0.4moIL 各引物、0.lmmol/L（美国 Promega 公 司） 、1.5mmol/L MgCl2、1.2U Taq DNA 聚合酶及其 l反应缓冲液 (Promega 公司)。 PCR 在 GeneAmp 2400 热循环仪 （Perkin Elmer 公司） 上进行，其条件为：94预变性 2min 后于 94 30 s、61 30s 和 72 30s 进行 30 个循环，最后 72延伸 7min。 C677T 基因型由限制性核酸内切酶 Hinf
16、（New England Biolabs 公司）鉴别：677CT 突变后可被 Hinf酶切，因此，纯合变异的基 因型的 PCR 产物经酶切后产生 175bp 和 23bp 两个片段， 杂合子产生 198、175 和 23bp 3 个片段，而野生型基因型只有 198bp 一个片断。 酶切(37，4h)产物于 3Metaphor 琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭 染色。MTHFR 基因多态性于浙大肿瘤研究所检测。 HinfI-treated MTHFR gene PCR fragments. Lane M: pBR322/Msp I marker; Lane2, 8, 9 CC genotype Lane 3, 5, 6, 7 CT genotype Lane 1, 4 TT genotype 浙江大学 2005 届硕士医学专业学位论文 5 2
