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1、 一株硫酸盐还原菌的分离筛选及生理特性的初探学生 指导老师 乐以成 摘要：硫酸盐还原菌利用其它细菌的代谢终产物作为自己的能源而生长，其本身又是还原活动的参与者。而硫酸盐有机废水生物处理技术一直是人们关注的热点，这种废水处理的关键是如何在有效去除COD的同时，高效的去除SO42-。硫酸盐还原菌在一定的条件下可以有效的将SO42-还原从而从废水中去除，并在该过程中起主要作用。为了更深入的研究其过程机理，比较好的做法是把在那种在数量上占优势，并且起主要功能的种群分离出来，对它们进行单独研究。本文利用厌氧装置和滚管技术，于广东化工集团硫酸厂废水污泥中分离和筛选了一株硫酸盐还原菌，命名为SRB6。并对其
2、生理生化指标进行了测定。菌体为短杆状或弧状，0.50.6m ，革兰氏染色阴性，不产芽孢。有Fe2+时菌落为黑色，直径为2mm，无Fe2+时固体培养基上的菌落为灰白色，直径1.5mm。利用乳酸盐作为最佳碳源。最适生长盐浓度为0.5%（W / V ），最适生长温度为35，最适pH值为7.0。根据形态和生理生化特征，该菌为脱硫弧菌属。但与该属已报道的硫酸盐还原菌在碳源利用、最适生长温度、最适盐浓度及其它一些生理特征方面均有不同。关键词：硫酸盐还原菌、厌氧培养、Hungate试管ISOLATION AND PHYSIOLOGY OF A SULFATE-REDUCING BACTERIUMStuden
3、t Teacher Abstract ： Sulfate-reducing bacteria use the final production of other bacteria as the energy source , and it also participate in the reducing action . The biological treating technology is always the focus of researchers in the world . The key of this technology is to remove COD and SO42-
4、 simultaneously and effectively . Sulfate reducing bacteria can reduce SO42- to H2S as to rtemove SO42- . To study physiological mechanism in depth , we isolating main functional group , SRB can simplify this research . Preponder ant population of SRB were isolated . Using anaerobic set and Hungate
5、tube technic , a sulfate-reducing bacteria was isolated from the wastewater of Chemical Industry Corporation Vitriol Factory . And we mensurate its physiology guide. The strain is gram negative and not spore forming . Its short rod or arc , and single cell is about 0.50.6 m wide and 1.72.0 m long .
6、Colonies from roll tubes without Fe2+ are grey white and about 1.5mm in diameter . When media contain , Fe2+ the colonies are black and about 2mm in diameter . It utilize lactate as carbon source . For its growth , the optimum NaCl concentration range is 0.5%（W/V) , temperate 36 and pH 7.0 . The str
7、ain belongs to Desulfovibrio and differ from the previously describe sulfate-reducing bacteria in its optimum growth temperate , carbon source and other characters .Key word ： Sulfate Reducing Bacteria ，anaerobic culture ，Hungate tube 引言硫酸盐还原菌(Sulfate Reducing Bacteria，简称为SRB)是一些能够把SO42-还原成S2-而自身获得能
8、量的各种细菌的统称，其利用硫酸盐取代好氧生物所用的氧为呼吸的氧化剂。它最基本的特征就是其生命活动需要硫酸盐，除了少量用于组成细胞成分，主要是用于在厌氧氧化有机物质时作为最终电子受体，所以SRB在自然界中的硫循环中起着不可缺少的作用。因为各类硫酸盐还原菌分布于不同的生态环境之中，故它们的生长温度范围、生长盐浓度范围、生长pH范围等各项生长指数的差异都很大。大部分硫酸盐还原菌嗜中温，中度嗜盐，在偏碱性的环境中生长。硫酸盐还原菌的形态和营养也是十分多样化，其常见的形态有杆状，短杆状，椭圆或长丝状。而SRB各属所能利用的碳源、硫源以及它的生长条件更是不尽相同。大部分硫酸盐还原菌能利用C3和C4脂肪酸、
9、挥发性脂肪酸以及醇类如乳酸盐，丙酸盐，乙酸盐，甲酸盐，乙醇等作为碳源和电子供体，而在厌氧条件下，SRB同化这些有机物时可以以硫酸盐，亚硫酸盐或其它含硫化合物作为电子受体，将其还原为H2S。铵盐则是大多SRB生长所需的氮源。根据前人的研究，SRB的代谢活动分为三个阶段。第一阶段是有机物碳源的降解，发生在厌氧状态下，同时通过“基质水平磷酸化”产生少量的ATP；第二阶段中，前一阶段释放的高能电子通过SRB中特有的电子传递链(如黄素蛋白、细胞色素C等)逐级传递，产生大量的ATP。在最后阶段中，电子被传递给氧化态的硫元素，并将其还原为S2-，此时需要消耗ATP提供能量。从这一过程可以看出，有机物不仅是S
10、RB的碳源和电子供体，也是其能源，硫酸盐(或氧化态的硫元素)仅作为最终电子受体起作用。硫酸盐还原菌对环境有较强的适应能力，因而具有与环境相适应的特殊结构，机能和遗传基因。了解其其细胞结构、遗传特性以及其适应极端环境的生物化学机制，可以丰富对这一生命现象本质的认识，为生物进化，微生物分类等研究积累数据，又可望发掘新的微生物资源，而且其特殊的基因为创造新的物种提供了可能。另外，SRB虽然会引起环境污染，但 SRB还有其较高的经济价值，即在污水处理中及在生物学和生态学中的所显示出的独特作用。因此，要全面地认识SRB，才能利用它在自然界和国民经济中的作用为我们造福。 我们从广东化工集团硫酸厂的废水污泥
11、中分离了一株硫酸盐还原菌，测定其形态、大小、各项生理生化指标以及它对碳源和硫源的利用情况等，为进一步研究其功能打下了基础。1. 材料和方法1.1 实验材料1.1.1 采集土样2007年8月3日于广东化工集团硫酸厂采集废水污泥。1.1.2 培养基（1000mL）SRB（LS）培养基配方（配方参考农业部沼气所厌氧微生物重点开放实验室）NaCl 2g NH4Cl 1g K2HPO4 0.5g Na2SO4 0.5gMgSO4 7H2O 2g CaCl2 0.1gFeSO4( NH4 ) ( SO4 )2 6 H2O 0.5g 70%乳酸 5mL酵母膏 1g pH 7.0固体培养基则加1%到2%的琼脂
12、。1.2 药品和试剂无菌水，NaCl， NH4Cl ， K2HPO4 ， CaCl2 ，MgSO4 7H2O，70%乳酸，酵母膏 ，琼脂，Na2SO4，FeSO4( NH4 ) ( SO4 )26 H2O；甲酸钠，乙酸钠，丙酸钠，乙醇，葡萄糖；Na2SO3 、Na2S2O3 ，硫磺；结晶紫染液，碘液，95%乙醇，番红染液，孔雀绿染液。1.3 实验器材组培罐，富集培养瓶，恒温培养箱，分液器，恒温水浴锅，血浆瓶，厌氧装置，滚管机，Hungate试管，无菌注射器（2.5mL），酒精灯，毛细管，分光光度计（721型 ），pH试纸，PbAc试纸，荧光光学显微镜，显微镜测微尺 。1.4 实验方法 1.4.
13、1 筛菌1.4.1.1 SRB的富集培养. 以1g：10mL的比例用无菌水稀释土样。. 以1:10的比例量取20mL土样悬液，接入到200mL富集培养基中，34培养。. 7d后培养基变黑，产气泡，说明SRB已大量生长。1.4.1.2 培养基的分装 . 培养基按如上配方配好后，调pH至7.0，并置于电炉上煮开，目的为尽可能的制造厌氧环境。. 对分液器的标定刻度进行校准。. 校准后将分液器固定于三角瓶上，并持续通入氮气，以达到厌氧环境。. 于待分装的试管中也通入氮气，20s后装入4.5mL培养基，并迅速盖上塞子。. 121高压灭菌30min。注：因为该培养基中不含葡萄糖等糖类，如培养基中含糖，则在
14、115下灭菌30min。1.4.1.3 Hungate滚管该技术利用除氧铜柱来制备高纯氮，并用高纯氮驱除小环境中的空气，使培养基的配制、分装、灭菌和贮存，以及菌种的接种、培养、观察、分离、移种和保藏等过程始终处于高度无氧条件下，从而保证了这类严格厌氧菌的存活。在进行严格厌氧菌的分离时，可用Hungate的“无氧操作”把菌液稀释，并接种到融化后的固体培养基中，然后将此试管(如图1)用丁基橡胶塞严密塞住后平放，置冰浴中均匀滚动，使含菌培养基布满在试管的内表面上，犹如好氧菌在培养皿平板表面一样，最后长出许多单菌落。注：滚管技术的优点是：试管口与空气接触面积小；经滚动后，试管的内表面上有大面积的固体培养基可供长出单菌落。 图1.用于滚管技术中Hungate的试管剖面图步骤： . 将装在亨格特试管中的固体培养基在沸水浴中熔化，同时将恒温水浴
