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1、一株丝状真菌的分类鉴定与特性研究生物系 王凡指导老师 赵文婧 韩建荣摘要；运用载片观察法和菌落平板培养法对本实验室分离到的丝状真菌Mars进行了培养观察，并与标准菌球孢白僵菌（Beauveria bassiana）3.4428进行比较，初步鉴定Mars可能属于白僵菌属 (Beauveria)。采用明胶琼脂平板法测定了Mars和3.4428的胞外蛋白酶，结果表明Mars的胞外蛋白酶酶活略小于3.4428。另外，实验测定了Mars和3.4428的产孢量，发现Mars的产孢量小于3.4428。并进行了室内感染松毛虫毒力的比较，结果显示3.4428的毒力强于Mars。关键词：丝状真菌；观察鉴定；胞外蛋
2、白酶；产孢量本实验室分离到一株丝状真菌Mars，它在Mas培养基上能产生明显的溶钙圈，在牛奶培养基中培养能导致酸凝，并且使培养基由白色变为紫红色。该菌株在多种培养基上培养都没有发现有性孢子，初步鉴定是一种半知菌。本实验对该菌株进行了形态观察，并与购于中科院的标准菌株球孢白僵菌（Beauveria bassiana）3.4428相对比，以确定该菌株的准确分类地位。另外，根据球孢白僵菌所具有的一些生理生化特征，本实验对Mars的产孢量，胞外蛋白酶的活力及毒力等特性进行了初步研究。1 材料与方法1.1 供试菌株Mars菌株，保存在PDA斜面上，由山西大学微生物实验室提供。标准菌株球孢白僵菌（Beau
3、veria bassiana）3.4428购于中国科学院北京微生物研究所，保存在查氏斜面上。1.2 试剂Hgcl2，吐温-100，磷酸缓冲溶液等。1.3仪器高压蒸气灭菌锅，超净工作台，恒温培养箱，电子显微镜，电子天平等。1.4 培养基共使用下列培养基12：马铃薯培养基（PDA），添加了蛋白胨的马铃薯培养基（PPDA），查氏培养基（CA培养基），明胶琼脂培养基：平板由1的明胶和1.5的琼脂配成。1.5实验方法1.5.1固体平板培养法从PDA斜面和CA斜面上分别挑取少量孢子接种到PDA、CA、PPDA平板上，25黑暗培养观察菌落形态。 1.5.2载片观察法1将圆形滤纸铺于培养皿的底部，其上放一U形
4、玻棒及盖玻片和载玻片各一片，盖好培养皿盖，灭菌；用无菌玻棒直接蘸取已融化的固体培养基滴于培养皿中载玻片的中央；用接种环取少量孢子接种于载玻片上培养基小块的四周，加上盖玻片，并略向下轻压；为防止培养过程中培养基干燥，可于培养皿中的滤纸圆片上滴加无菌的20%甘油液3-4毫升，盖好皿盖；将盖好的培养皿置适宜的温度下培养，定期取出，观察显微结构。 1.5.3胞外蛋白酶的测定（使用明胶琼脂平板法3）平板由1的明胶和1.5的琼脂配成，各待试菌株配成1108孢子/mL的孢子悬液，用微量取样器取25L点滴在平板中央。每待试菌株6次重复，25黑暗培养三天，用15%的HgCl2（溶于2mol/L的盐酸）溶液处理,
5、待菌落周围显现清晰的透明环后，倒去HgCl2，用直尺测量纵横两个方向的透明环直径和菌落直径，以透明环和菌落直径平均值之比作为胞外蛋白酶产酶量的指标。1.5.4产孢量的测定4分别将Mars和3.4428接种于PDA培养基、PPDA培养基、CA培养基上，25黑暗培养10d后，每个处理设置3个重复，在菌落核心至1/2处用直径为4.5mm打孔器打孔取样,置入盛有10mL 0.1吐温水的500mL三角瓶中，手摇震动10-15min。用两层纱布过滤后得孢子悬液，用无菌滴管滴一滴于血细胞计数板上，小心加放盖玻片，避免产生气泡，在显微镜下直接计数。从血细胞计数板上每个小方格（体积1/5，000，000mL）中
6、的孢子数可进一步计算出3个重复单位面积产孢量的平均值。计算公式如下：样品孢子数/mm2=A525104稀释倍数15.91.5.4毒力测定4配制2108个/mL,2107个/mL的两种不同浓度的孢子悬液，挑取大小均匀、健康活泼的供试松毛虫虫体，取新鲜的松针孢子液中浸510s，取出停留23s，连同供试虫（100头）一并放入干净玻璃制养虫缸（直径10cm，高15cm）中，用白纱窗布罩住缸口，每个处理设三次重复，空白对照不喷任何物质，注意喷洒前先将菌液摇匀，后置入恒温培养箱中在25下黑暗培养，处理后3d更换新鲜松针，以后每2d更换1次松针，并在培养箱中放入湿棉花以保持湿度，至少保证湿度在75%左右，每
7、2d定时检查幼虫的死亡情况，同时拣出死虫，PDA平板保湿培养以确诊死因。在除去虫粪，计算校正死亡率，并求死亡中时LT50。2 结果与分析2.1 载片观察法结果及分析将接有Mars与3.4428孢子的载玻片培养7d后，从培养箱中取出，将载玻片直接置于显微镜上观察。具体形态特征59描述如下： Mars：营养菌丝无色，粗1.23.0m，分生孢子梗多着生于营养菌丝上，产孢细胞常浓密簇生于菌丝或泡囊上，有时可多达十几个，极少数单生，产孢细胞基部多为球形，近球形，少柱形，个别产孢细胞基部特化为较长的细丝。颈部明显延长成粗1m，长达14m的产孢轴。轴上具小齿突，呈膝状弯曲（“之”字形弯曲），培养后期，在低倍
8、镜下常见球型的密集孢子头（由泡囊，产孢细胞和分生孢子组成），分生孢子透明，光滑，多为亚卵型和椭圆型。（见图1、图2）。 Beauveria bassiana 3.4428：营养菌丝无色，粗1.23.0m,分生孢子梗多着生于营养菌丝上，产孢细胞常簇生于菌丝或泡囊上，最多可达7个，少数单生，产孢细胞基部多为球形，近球形，少柱形，产孢轴较长，可达17m。轴上具小齿突，呈膝状弯曲（“之”字形弯曲），培养后期，在低倍镜下常见球型的密集孢子头（由泡囊，产孢细胞和分生孢子组成），分生孢子透明，光滑，多为亚卵型和椭圆型，个别为长柱型。（见图3、图4）。图 1 Mars菌株的产孢结构（40） 图2 Mars菌株
9、的产孢结构（10）图3球孢白僵3.4428 的产孢结构（40） 图4球孢白僵菌3.4428的产孢结构（10）通过实验观察，虽然Mars和3.4428在显微结构上有很大的相似性，但二者之间仍有细微差别。详见表1。表1 Mars与3.4428的异同菌株孢子头产孢细胞分生孢子Mars可见密集的孢子头大多数浓密簇生，多达十几个,极少数单生，产孢轴“之”字形 结构弯曲幅度较大，偶在短,的产孢轴顶端可发出不孕的细长的产孢丝.分生孢子透明光滑，多为球形、亚卵形，个别为长柱形.3.4428可见较密集的孢子头大多数簇生，最多达七个，少数单生，产孢轴“之”字形结构弯曲幅度较小.分生孢子透明，光滑，多为球形、亚卵形
10、.2.2 固体平板培养观察10结果接种后的平板培养7d后，从培养箱中取出，观察菌落形态由表2可以看出在不同的培养基上Mars与3.4428的菌落形态比较相似，这两种菌在PPDA培养基上的菌落形态都有褶皱，呈辐射状分支，在PDA和CA培养基上菌落都无褶皱。所不同的是Mars的菌落形态呈绒毛状，在PPDA培养基上基质色泽为墨绿色；3.4428的菌落形态呈毛毡状。（详见表2）。表2 25培养7天的菌落形态菌株培养基菌落质地菌落色泽基质色泽Mars3.4428PPDAPDACAPPDAPDACA致密绒毛状，有褶皱，呈辐射状分支致密绒毛状，无褶皱稀疏绒毛状，无褶皱毛毡状，有褶皱，呈辐射状分支毛毡状，无褶
11、皱毛毡状，无褶皱白色乳白色乳白色乳白色乳白色白色墨绿色淡黄色淡黄色黄色淡黄色橙黄色2.3不同培养基上的产孢量结果通过测定Mars与3.4428在3种不同培养基上的产孢量，可以看出Mars的产孢量低于3.4428。所用的三种培养基中Mars在PDA培养基上的产孢量最大，而3.4428在PPDA上的产孢量最大。（具体数值见表3）。表3 不同培养基上的产孢量及平均值菌株培养基产孢量 （106mm2）1 2 3平均值Mars3.4428PPDAPDACAPPDAPDACA1.48 1.54 1.763.11 2.39 2.993.68 2.36 2.018.05 7.89 8.086.70 4.66
12、3.623.93 4.21 4.841.592.832.688.014.994.332.4胞外蛋白酶的结果 利用明胶琼脂培养法测定了Mars和3.4428的胞外蛋白酶产量，结果表明Mars的胞外蛋白酶产量略低于3.4428。（具体数值见表4）。表4 Mars和3.4428的胞外蛋白酶产量比值及平均值。菌株胞外蛋白酶产量比值 1 2 3 4 5 6平均值 3.4428Mars2.06 2.13 1.94 2.03 1.95 2.99 1.83 2.00 2.02 2.08 2.13 1.772.101.972.5毒力测定结果表5不同种类和不同浓度百僵菌对油松毛虫的室内感染死亡情况菌株浓度（个/m
13、l）试虫（头）不同时间幼虫的校正死亡率%2d 4d 6d 8d 10dMars3.442821072108210721081001001001002 28 40 47 655 31 47 63 793 35 51 68 826 41 54 77 96 表6不同种类和不同浓度百僵菌对油松毛虫的室内感染死亡情况菌株浓度（个/ml）回归方程(Y=a+bX)相关系数（R）死亡中时LT50显著性检验Mars3.44282107210821072108Y=0.826X-0.227Y=1.013X-0.275Y=1.090X-0.302Y=1.213X-0.3210.9850.9840.9940.9797.595.965.454.75*注：X=lgd(天数) Y=校正死亡率 结果表明，浓度是影响白僵菌分生孢子萌发、菌丝生长速度及白僵菌致
